四川乐山地区种鸭场沙门菌鉴定与耐药性分析

尹 皑 ， 黄 毅 ， 韩和祥

(眉山职业技术学院农业技术系 ， 四川 眉山 620010)

沙门菌(Salmonella)可以引起鸡、鸭、鹅、牛、羊、狐狸等多种动物及人发病，临床中以急性、慢性或隐性感染为常见，该菌在禽类中主要通过水平传播和垂直传播，致使该病在禽类养殖过程广泛流行，尤其对幼禽危害较大，感染率和死亡率均较高，成为禽类养殖过程中重要疾病之一[1]。国内相关研究表明，禽类是沙门菌储存库之一，该菌可以通过食品引起人食物中毒，经过统计每年沙门菌中毒可占细菌性食物中毒的42.6%以上，对人类危害较大[2-3]。鸭沙门菌病又叫鸭副伤寒，该病可以感染不同日龄的鸭，尤其对3周龄以内的雏鸭最易感，临床主要以急性和亚急性症状为常见，感染率和死亡率与幼禽的日龄密切相关[4]。相关研究表明，沙门菌具有2 600 多种的血清型，其中感染鸭的沙门菌常见血清型主要有鸭沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等[5]。抗生素是控制沙门菌感染有效的手段，在养殖过程中抗生素的超剂量滥用，导致沙门菌病出现了耐药性增强和多重耐药增高的变化趋势，对人类的健康存在潜在危害，应该引起重视[6]。本试验于2019—2020年从四川乐山地区种鸭场采集种鸭肛拭子、死胚、病死雏鸭等病料组织204份并进行沙门菌分离和鉴定，检测沙门菌的血清型和耐药性。本试验为指导种鸭场沙门菌的用药与防控提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2019—2020年采集四川乐山地区种鸭场的种鸭肛拭子、死胚、病死雏鸭等病料组织204份。

1.1.2 主要试剂 S.S.培养基、沙门菌显色培养基、普通营养肉汤，均购自青岛海波生物科技有限公司；沙门菌生化鉴定试纸条，购自广东环凯微生物科技有限公司；临床中常用的兽用药敏纸片，购自北京天坛药物生物技术开发公司；沙门菌属诊断血清，购自中国食品药品检定研究院；DL1 000 Marker、2×TaqMaster Mix，均购自宝生物工程(大连)有限公司。常规仪器与试剂由本单位实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与培养 对疑似感染的沙门菌病料经过处理后，接种于S.S.培养基37 ℃培养12 h后，挑取S.S.培养基单个菌落接种于沙门菌显色培养基，37 ℃培养12 h，染色镜检观察其形态学。

1.2.2 细菌生化鉴定 按照说明书方法对分离菌株进行生化特性检测与鉴定。

1.2.3 细菌PCR鉴定 参考文献[7]，根据GenBank中发表的序列，针对沙门菌invA和hut基因 (AE014613.1) 设计 2 对特异性引物，设计鉴定引物invA，5′- CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′，5′- T-GCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′,目的片段大小为185 bp；hut：5′-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGC-3′，5′-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGa-3′，目的片段大小为495 bp；引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。采用细菌DNA试剂盒以提取菌株的基因组DNA为模板进行PCR鉴定，PCR产物测序，测序结果与GenBank中沙门菌株进行同源性比对。

1.2.4 血清型检测 参考文献[8]报道的方法，采用Kauffmann-White法对分离的沙门菌进行血清型检测。

1.2.5 药敏试验 药敏试验参照美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的标准K-B纸片法进行，分析分离菌株的耐药性。

2 结果

2.1 细菌的分离和鉴定 疑似沙门菌分离菌株在S.S.培养基上长出圆形、边缘整齐、灰白色的菌落，个别的菌落产硫化氢，呈中间黑心菌落；沙门菌显色培养基上长出边缘整齐、大小一致的紫色菌落。染色镜检进行形态学观察，分离菌株为两端钝圆、无荚膜的阴性短杆菌。分离的75株疑似沙门菌的菌株生化鉴定均为沙门菌。

2.2 细菌PCR鉴定 对分离的菌株用引物invA和hut进行PCR鉴定，结果显示，分离的75株菌株均扩增出大约为185 bp 和495 bp的目的条带(图1)。测序结果表明，分离的75株菌株均鉴定为沙门菌。

图1 75株分离菌株的PCR鉴定结果Fig.1 PCR results of 75 isolated strainsM:DL1 000 marker； 1～15：分离菌株； 16：空白对照M:DL1 000 marker; 1-15: Isolated strain; 16:Blank control

2.3 血清型检测 用Kauffmann-White法对分离的种鸭源沙门菌进行血清型鉴定，结果显示，分离的75株沙门菌分别属于12种血清型，其中禽伤寒沙门菌(25.3%)、鸭沙门菌(20.0%)、肠炎沙门菌(17.3%)3种血清型为该地区的流行优势血清型(表1)。

表1 75株沙门菌分离株的血清型检测结果Table 1 Serotype results of 75 Salmonella isolates

2.4 药敏试验与多重耐药性分析 由表2可知，分离的75株沙门菌耐药性严重，对阿莫西林、氨苄西林等9种药 物耐药率较高，耐药率介于77.3%～98.7%；对多西环素、环丙沙星、氨曲南等5种药物的耐药率介于45.3%～64.0%；对头孢曲松、头孢噻呋、恩诺沙星、林可霉素4种药物的耐药率较低，介于13.3%～22.7%。

表2 75株沙门菌分离株的药敏试验结果Table 2 Drug sensitivity results of 75 Salmonella isolates

由表3可知，临床中分离的75株沙门菌呈现多重耐药性，耐 17 种药物有 1 株、耐 16、7 种药物各 3 株、耐 15、9、6种药物各 4 株、耐 14、8 种药物各有 6 株、耐13种药物有 5株，耐 12、11、10 种药物分离菌株最多，分别占分离菌株的 16.0%、18.7%和17.3%。

表3 75株沙门菌多重耐药性检测结果Table 3 Detection of multidrug resistance of 75 Salmonella strains

3 讨论

沙门菌是临床中重要的人兽共患病原菌，该菌血清型众多，我国共报道约290种血清型，对动物和人类的危害比较大，鸡和鸭是主要食源性动物，是人类感染沙门菌主要的来源之一，沙门菌病已经严重威胁到人类的健康，应引起重视[9-10]。近年来，关于沙门菌感染的报道逐渐增多，严重影响我国禽类养殖业的发展。任士飞等[7]报道从徐州及周边地区分离得到49 株鸭源沙门菌，以印第安纳沙门菌、阿贡纳沙门菌和鸭沙门菌为主要流行优势血清型。张林吉[2]报道了在徐州地区分离的26株鸭源沙门菌以肠炎沙门菌为主。许明等[11]研究表明，从江苏地区分离的 33 株沙门菌以查理沙门菌血清型为主。本试验结果表明，2019—2020年从四川乐山地区种鸭场采集种鸭肛拭子、死胚、病死雏鸭等病料组织204份，分离得到75株沙门菌，分离的沙门菌属于12种血清型，以禽伤寒沙门菌、鸭沙门菌、肠炎沙门菌为流行优势血清型。本试验与上述报道的鸭源血清型存在一定差异性，可能与地区有关，不同地区流行的血清型也不一样。鸭场沙门菌广泛流行与传播方式有关，该菌既能水平传播，又能垂直传播，种鸭通过卵传播给下一代，导致该菌在养殖场中广泛发生与流行[12]。因此，规模化养殖场应该注重该病的防控与净化，减少该病发生。

近年来，养殖场中由于抗菌药物不合理使用，导致沙门菌耐药菌株逐渐增多，出现多重耐药菌株，给该病的防控带来了一定难度，且沙门菌耐药性可以通过食物在人和动物中传播，给人类的健康造成潜在的威胁[12]。本试验表明，分离的75株沙门菌对临床常用抗生素耐药性较严重，对阿莫西林、氨苄西林、链霉素等13种药物耐药率在45.3%以上，出现多重耐药性，其中耐 12、11、10 种药物分离菌株最多。说明从四川乐山地区种鸭场分离的沙门菌耐药性较强，呈现多重耐药性。与张林吉等[4]、任士飞等[7]、常江等[13]报道的存在一定的差异性，可能与地区、药物使用情况有关。因此，在规模化养殖场中应该注重抗生素的合理使用。本试验为四川乐山地区种鸭场沙门菌防控提供参考依据。