多重耐药肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体Kp-8329的分离鉴定和基因组分析

刘家齐 ， 于 新 ， 田 爽 ， 董长安 ， 黄红兰

(1. 吉林大学基础医学院 ， 吉林 长春 130021 ； 2. 吉林百合口腔医院 ， 吉林 长春 130022)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是重要的条件致病菌之一，其导致的疾病在克雷伯菌中占比超过95%[1-2]，包括肺炎、脑膜炎和败血症等。近年来，由于大量使用氨基糖苷类等抗生素，导致耐药菌的数量越来越多，耐药率越来越高[3-5]。噬菌体是感染细菌、真菌等病毒的总称，同时也是地球上数量最大的生物群体，是细菌数量的10倍。噬菌体进入宿主菌进行复制，使得宿主菌发生裂解，同时释放大量子代噬菌体，可以考虑应用于细菌感染的治疗。噬菌体自1896年被发现以来，探索过程并不是一帆风顺，抗生素的广泛使用使噬菌体慢慢淡出了人们的视野，近年来，抗生素耐药情况越来越多，加之超级细菌的产生，使得人们越来越关注噬菌体。本试验对肺炎克雷伯菌噬菌体进行分离，观察其生物学特点，分析其遗传信息，为今后应用噬菌体治疗肺炎克雷伯菌感染提供数据支持，也为临床治疗起到积极作用。

1 材料与方法

1.1 材料来源 肺炎克雷伯菌临床分离株，来自吉林大学第二医院，作为分离噬菌体的宿主菌，经质谱仪(型号为VITEK MS)鉴定，将其命名为8329。应用吉林大学第二临床医院检验科法国梅里埃药敏鉴定仪器测定宿主菌8329对19种抗菌药的敏感性，结果显示该菌株对头孢呋辛钠、头孢他啶、头孢替坦、头孢吡肟、亚胺培南、头孢呋辛酯、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林8种抗菌药全部不敏感，故为多重耐药菌。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体Kp-8329的分离 采集吉林大学白求恩第一医院污水中心未经处理的污水，离心取上清，加入1 mL肺炎克雷伯菌对数期菌液，50 mL 营养肉汤(NB)培养基，160 r/min 37 ℃培养7 h，4 ℃ 8 000 g离心30 min，用0.22 μm滤器过滤上清液。于试管中加入0.1 mL对数期菌液和0.1 mL上述滤液，混匀后室温孵育10 min，采用双层平板法[6]观察是否有噬斑出现。

1.2.2 噬菌体Kp-8329的电镜观察 取20 μL纯化后的噬菌体液滴至铜网，室温下静置15 min，滴加2%磷钨酸染色15 min，透射电镜观察形态[7]。

1.2.3 噬菌体Kp-8329的生物学特性分析 双层平板法[8]对噬菌体的一步生长曲线、最佳感染复数、温度和pH稳定性进行测定。

1.2.4 噬菌体Kp-8329的DNA提取及测序 按噬菌体DNA抽提试剂盒说明书(北京艾德莱生物科技有限公司)提取噬菌体DNA，送生物公司测序。用Newbler 2.9软件组装基因组序列，使用RAST 2.0预测基因及功能注释，用MEGA 6.0构建系统进化树。

2 结果

2.1 噬菌体Kp-8329的分离 以肺炎克雷伯菌8329为宿主菌，噬菌体来自吉林大学白求恩第一医院废水，其噬斑形态均为圆形，如图1所示，噬菌体Kp-8329可在菌苔上形成直径3～5 mm，边缘清晰，大小均一的圆形噬斑，在噬斑周围有1个半透明的晕环，宽度约5 mm。

图1 噬菌体Kp-8329的噬斑Fig.1 Plaque of phage Kp-8329

2.2 噬菌体Kp-8329的电镜观察 使用透射电镜观测噬菌体形态，如图2所示，该噬菌体由对称的多面体立体头部和尾部组成，头部直径为45～50 nm，有1条 尾，长为130～140 nm。按照国际病毒分类委员会(ICTV)的分类规则，噬菌体Kp-8329属于有尾噬菌体目、长尾病毒科噬菌体。

图2 噬菌体Kp-8329的电镜观察Fig.2 Electron microscopy observation of phage Kp-8329

2.3 噬菌体Kp-8329的生物学特性

2.3.1 噬菌体Kp-8329的最佳感染复数(MOI) 通过双层平板法对噬菌体MOI进行测定,MOI为0.01，如表1所示，即在噬菌体滴度和宿主菌浓度比值是0.01的情况下，能够获得最大量的噬菌体产物。

表1 噬菌体Kp-8329最佳感染复数测定Table 1 Determination of the optimal multiplicity of infection of phage Kp-8329

2.3.2 噬菌体Kp-8329的一步生长曲线 如图3所示，Kp-8329感染宿主菌的潜伏时间大约为15 min；裂解期持续15 min；爆发量为147 PFU/cell。

图3 噬菌体Kp-8329的一步生长曲线Fig.3 One-step growth curve of phage Kp-8329

2.3.3 噬菌体Kp-8329的温度稳定性 如图4所示，噬菌体Kp-8329的热稳定性较强；40 ℃培养60 min后，滴度未出现明显的改变；在60 ℃作用60 min后，噬菌体滴度略下降；当温度达到80 ℃时，噬菌体几乎完全失活。

图4 噬菌体Kp-8329的温度稳定性Fig.4 Temperature stability of phage Kp-8329

2.3.4 噬菌体Kp-8329的pH稳定性 如图5所示，当pH为5～12时，噬菌体Kp-8329有较高的活力；pH为4时，存活率有所下降；而pH在1～3和13～14 变化时，噬菌体均失活。

图5 噬菌体Kp-8329的pH稳定性Fig.5 pH stability of phage Kp-8329

2.4 噬菌体Kp-8329全基因组概述 如图6所示，Kp-8329基因组全长46 907 bp，G+C含量为46.90%，未检出 tRNA 和 rRNA。根据美国国家生物信息中心(NCBI)的BLAST程序，针对开放阅读框(ORF)来实施功能注释，116个ORFs中有32个ORFs与数据库中已经公开的功能蛋白有较高相似度，余下84个ORFs注释为功能未知的假定蛋白，在噬菌体Kp-8329中未查出毒力因子和抗生素的耐药基因，证明噬菌体Kp-8329在日后的临床应用中存在一定的安全性。

图6 噬菌体Kp-8329全基因组结构示意图Fig.6 Schematic diagram of the whole genome structure of phage Kp-8329

2.5 噬菌体Kp-8329与同属噬菌体的进化关系分析 如图7所示，噬菌体Kp-8329的基因组的进化关系中，没有查出和其进化关系相似的肺炎克雷伯菌噬菌体。

图7 Kp-8329与同属噬菌体的进化关系邻接树Fig.7 Neighbor-joining tree of evolutionary relationship between Kp-8329 and the same phage箭头：噬菌体Kp-8329所在进化树分枝；下图同Arrow: The branch of the evolutionary tree where the phage Kp-8329 is located.The same as beolw

2.6 噬菌体Kp-8329 DNA聚合酶基因的进化关系分析 如图8所示，基于DNA聚合酶基因的进化关系表示，该噬菌体和大肠埃希菌属噬菌体之间的进化关系十分相似。

图8 Kp-8329 DNA聚合酶基因的进化关系邻接树Fig.8 Neighbor-joining tree of evolutionary relationship of Kp-8329 DNA polymerase gene

3 讨论

近年来耐药细菌的治疗越来越困难，世界卫生组织(WHO)更是认为细菌耐药是21世纪以后的最大难题之一[9]。噬菌体疗法是有效解决抗生素耐药性的候选者之一。但有些噬菌体携带耐药基因或毒力基因，在临床上不适用，所以，需要对其全基因组测序，了解其基因组结构和进化关系，为其今后应用提供数据支持[10]。

本试验自医院未经处理的污水中分离出噬菌体Kp-8329，该噬菌体是典型的有尾目噬菌体，潜伏期短，爆发量大，具有较高的酸碱稳定性，pH在5～12变化范围内有较高的活力；对温度的耐受性也较好。对这些生物学特性的分析表明，噬菌体Kp-8329 作为一种有效、可靠和特异的生物制剂，在治疗临床众多感染，尤其是耐药性肺炎克雷伯菌感染方面有着较为广阔的发展前景和研究方向。

噬菌体Kp-8329基因组为线性双链DNA，大小为46 907 bp，G+C含量为46.90%，未检出 tRNA 和 rRNA，基因组中包含116个ORFs，32个ORFs可预测功能。按照功能不同可被划分成3个部分：结构蛋白模块，这些结构蛋白会在翻译后期包装组成完整的噬菌体结构，包括ORF18、ORF21、ORF29、ORF39、ORF42、ORF51、ORF63、ORF66、ORF74和ORF84；DNA 复制及组装模块，当噬菌体的遗传物质进入细菌体内后，噬菌体会利用细菌进行自身的复制及组装，这个模块主要是DNA代谢所需的相关蛋白，包括ORF8、ORF9、ORF10、ORF15、ORF22、ORF34、ORF54、ORF56、ORF58、ORF59、ORF77、ORF79、ORF80、ORF85、ORF96、ORF105、ORF110、ORF111和ORF114；裂解宿主模块，包括ORF17、ORF62和ORF72；其余为假定蛋白。深入分析上述ORFs的基因功能，可为噬菌体治疗多重耐药菌感染的研究提供科学依据。

通过已报道耐药基因库和毒力基因库比对可以得出，噬菌体Kp-8329没有耐药基因和毒力基因，这表明噬菌体Kp-8329在基因组水平方面具有安全性。分析进化关系时，没有发现和其进化关系十分相似的其他肺炎克雷伯菌噬菌体，而是与大肠埃希菌属噬菌体有较为相近的进化关系。本试验为今后的噬菌体基因组学、流行病学和噬菌体治疗等研究提供基础数据。