稻虾共育田酰胺类除草剂胁迫对克氏原螯虾幼虾生长发育的影响

王守红，吴雷明，杨显祥，韩光明，张家宏，*，寇祥明，王曙光，李兵

1. 江苏里下河地区农业科学研究所，扬州 225007 2. 扬州市水产生产技术指导站，扬州 225003 3. 江苏普兴循环农业发展有限公司，扬州 225654 4. 扬州市龙道生态农业有限公司，扬州 225615

稻田养渔最早记载于1 700年前的中国，目前已经成为中国、印度、日本及很多东南亚国家食物保障的重要水产养殖模式之一[1]。稻田养渔是种植业与养殖业有机结合的高效生态农业生产方式，是以提高稻田产出率并保持稻田良性生态环境为目的的一种生产模式。目前，我国是世界上稻田养渔面积最大的国家，并逐步出现了集约化、规模化、专业化、产业化、品牌化、产品向绿色、有机农产品方向发展的趋势[2]。水稻与鱼类互利互惠的生态学原理是稻田养渔复合系统的基础，两者结合促进了系统经济效益和环境效益的提升[3-4]。稻田综合种养模式与当地的文化、经济以及生态环境相结合，在保护当地生物多样性和维持农业可持续发展方面扮演着重要角色[5]。

水稻种植与水产养殖互利共惠的同时，两者不同的生产要素和需求无可避免会产生矛盾，稻田农药的环境行为就是其中之一[6-7]。水产动物的生命活动对水稻的病虫草害有一定的生物防治效果。稻渔综合种养模式中稻飞虱和纹枯病病株发病率分别降低44.74%和54.35%[8]，稻蟹综合种养模式对杂草的防控效率为26.53%～44.33%[9]。在旱改水的稻虾共作模式下，通过虾群活动控制田间杂草的危害，总体效果可达94.03%，而在水稻连作模式下的稻虾共作直播田，杂草发生量大，特别是千金子的危害难以控制[10]。综上所述，稻渔综合种养模式下，水产养殖动物并不能完全起到防控病虫草害的作用，仍需辅助化学防除、物理防控和生态防控等预防措施[11]。

稻田-克氏原螯虾(Procambarusclarkia)生态种养模式，是我国克氏原螯虾主要养殖方式之一[12]。如何解决水稻病虫害防治与克氏原螯虾养殖之间的矛盾[13]，即如何预防常用农药对克氏原螯虾的毒性效应是确保稻虾综合种养模式正常生产的关键之一。酰胺类除草剂发展迅速，产量逐年增长，在各类除草剂中名列第4位，仅排在氨基酸类、磺酰脲类和有机磷除草剂之后[14-15]。丙草胺和丁草胺作为稻田广泛应用的酰胺类芽前除草剂，主要用于防除禾本科杂草，具有高效性、选择性[7]。本文以克氏原螯虾幼虾为试验对象，研究了丙草胺和丁草胺2种酰胺类除草剂对克氏原螯虾生长发育的影响，以期全面评价酰胺类除草剂在稻虾综合种养模式中的环境安全，并指导农药合理使用。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验对象

克氏原螯虾幼虾来源于江苏普兴循环农业有限公司。选择规格整齐、附肢齐全、活动能力强的克氏原螯虾幼虾为试验对象，其平均体质量为(4.84±0.46) g。

1.2 试验药品

丙草胺有效成分含量为500 g·L-1，助剂成分为乳油，净含量0.07 L，生产厂家为先正达(苏州)作物保护有限公司；丁草胺有效成分含量为50%，助剂成分为乳油，净含量0.26 L，生产厂家为山东胜邦绿野化学有限公司。

1.3 养殖管理

幼虾暂养10 d，使其适应小水体环境，降低应激反应。试验采取静水试验法[16]，即采用一次性投药，不更换药水方式。设置对照组、丙草胺和丁草胺3个处理，每个处理设置3个重复，每个重复投放15尾。试验过程中丙草胺和丁草胺药物制剂浓度按照稻田常规剂量计算(丙草胺0.0021 mL·L-1；丁草胺0.0045 mL·L-1)，药物有效含量分别为1.05×10-3g·L-1和0.0023 mL·L-1。为降低残饵和粪便对养殖水体的污染，正式试验开展前1 d，停止投喂，于第6天取样结束后开始恢复投喂，按照幼虾体质量的1%计算投喂量(少量投喂)，投喂频率为每3 d投喂1次。如养殖过程中存在少量残饵，禁止捞出，减少试验药品投入总量的损失。日常记录幼虾死亡、蜕壳等情况。养殖水族箱容量为70 L，养殖水体为10 L，持续增氧。

1.4 样品采集

取样时间点为1、3、6、11和17 d。每个处理随机选取6只幼虾，首先采用电子天平测量体质量，随后立即进行解剖，取幼虾肝胰腺样品急冻低温保存。样品加0.85%生理盐水进行冰浴匀浆离心，取上清液，于4 ℃下保存用于后续分析，样品于24 h内分析完成。一部分用于测定胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，另一部分用于测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性及总抗氧化力(T-AOC)。取样前24 h停止投喂饲料，使肠道内容物排空。消化酶和抗氧化酶活性均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

1.5 数据统计分析

采用SPSS18.0软件进行描述性统计及多重比较(Duncan)等分析，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示无显著性差异。

2 结果(Results)

2.1 酰胺类除草剂对克氏原螯虾生长的影响

酰胺类除草剂对克氏原螯虾生长的影响如图1所示。第1天至第6天，丙草胺组和丁草胺组克氏原螯虾体质量与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。第11天和第17天，对照组克氏原螯虾体质量显著高于丙草胺组和丁草胺组(P<0.05)。丙草胺组与丁草胺组克氏原螯虾体质量在各取样时间点均无显著性差异(P>0.05)。丙草胺组和丁草胺组克氏原螯虾体质量显著低于初始值的时间为第11天(P>0.05)，对照组为第17天。丙草胺组和丁草胺克氏原螯虾蜕壳累计次数分别为5次和4次，对照组幼虾无蜕壳现象。整个试验养殖过程中，除丁草胺组1只幼虾因蜕壳被残食外，各组幼虾均无死亡个体。

图1 酰胺类除草剂对克氏原螯虾幼虾生长的影响注：不同小写字母表示同一时间不同处理组差异显著(P<0.05)； 不同大写字母表示同一处理组不同时间差异显著(P<0.05)。Fig. 1 Effect of amide herbicide on growth of Procambarus crustacean juvenileNote: Different lowercase letters mean significant differences among different treatments at the same time (P<0.05); different uppercase letters mean significant differences among the same treatments at different time (P<0.05).

2.2 酰胺类除草剂对克氏原螯虾消化酶活性的影响

酰胺类除草剂对克氏原螯虾幼虾消化酶活性的影响如表1所示。第1天时，丁草胺组克氏原螯虾胰蛋白酶活性显著低于对照组(P<0.05)，至第3天时两者无显著性差异(P>0.05)。整个试验过程中，丙草胺组幼虾胰蛋白酶活性与对照组均无显著性差异(P>0.05)。各组克氏原螯虾胰蛋白酶活性随着养殖时间的延长均呈显著性降低趋势(P<0.05)。第1天时，丙草胺组克氏原螯虾淀粉酶活性显著低于对照组和丁草胺处理组(P<0.05)。第3天时，丙草胺组克氏原螯虾淀粉酶活性显著低于对照组(P<0.05)，而与丁草胺组无显著性差异(P>0.05)。丁草胺组幼虾淀粉酶活性始终与对照组无显著性差异(P>0.05)。第6天时，丙草胺组克氏原螯虾淀粉酶活性显著低于对照组(P<0.05)，丁草胺组淀粉酶活性显著高于丙草胺组(P<0.05)。各组克氏原螯虾淀粉酶活性随养殖时间的延长呈先上升后降低的趋势。第6天时，丙草胺组克氏原螯虾脂肪酶活性显著低于对照组(P<0.05)，其他时间点各组克氏原螯虾幼虾脂肪酶活性无显著性差异(P>0.05)。各组克氏原螯虾脂肪酶活性随养殖时间的延长无明显变化规律。至11 d时，丙草胺组幼虾各消化酶活性与对照组之间均无显著性差异(P>0.05)，至3 d时，丁草胺组幼虾各消化酶活性与对照组之间均无显著性差异(P>0.05)。

2.3 酰胺类除草剂对克氏原螯虾抗氧化酶活性的影响

酰胺类除草剂对克氏原螯虾幼虾抗氧化酶活性的影响如表2所示。第1天时，丙草胺组克氏原螯虾SOD活性显著高于对照组和丁草胺组(P<0.05)，后两者之间无显著性差异(P>0.05)。第3天时，丁草胺组克氏原螯虾SOD活性显著高于对照组和丁草胺组(P<0.05)，后两者之间无显著性差异(P>0.05)。第6天时，对照组、丙草胺组和丁草胺组之间克氏原螯虾SOD活性无显著性差异(P>0.05)。

丙草胺组、丁草胺组和对照组之间克氏原螯虾CAT活性无显著性差异(P>0.05)，仅丁草胺组在第11天时显著高于对照组(P<0.05)。第1天时，丙草胺组和丁草胺组克氏原螯虾MDA含量显著低于对照组(P<0.05)，至第3天开始，3组之间无显著性差异(P>0.05)，仅丙草胺组在第11天时显著高于对照组和丁草胺组(P<0.05)。

第1天时，丙草胺组和丁草胺组克氏原螯虾GPx活性显著高于对照组(P<0.05)，第3天时，两者显著低于对照组(P<0.05)，至第6天时，三者之间无显著性差异(P>0.05)。第11天和第17天时，丁草胺组克氏原螯虾GPx活性均显著高于对照组和丙草胺组(P<0.05)，而后两者之间无显著性差异(P>0.05)。

丙草胺组克氏原螯虾T-AOC在第1天和第3天时显著高于对照组(P<0.05)，而丁草胺组至第11天时仍显著高于对照组(P<0.05)，第17天时，丙草胺组、丁草胺组和对照组之间无显著性差异(P>0.05)。至17 d时，丙草胺组、丁草胺组和对照组之间，除丁草胺组幼虾GPx活性外，各抗氧化酶活性均无显著性差异(P>0.05)。

表1 酰胺类除草剂对克氏原螯虾幼虾消化酶活性的影响Table 1 Effects of amide herbicides on digestive enzyme activities of Procambarus crustacean juvenile

3 讨论(Discussion)

营养不足会影响鱼类正常生理代谢水平，造成机体能量供应不足，并导致其生长率下降[17-18]。本研究结果显示，长期营养不足会导致克氏原螯虾体质量显著下降，同时，在丙草胺和丁草胺胁迫下，克氏原螯虾幼虾体质量损失率显著增大，相对于对照组，丙草胺组和丁草胺组克氏原螯虾幼虾体质量显著低于初始值的时间提前了6 d。甲壳类能量收支模型为：摄食能=生长能+粪便能+蜕壳能+排泄能+代谢能[19]。丙草胺组和丁草胺组克氏原螯虾均有多次蜕壳现象发生，同时在药物因素胁迫下，蜕壳能和代谢能等方面的能量消耗增加，导致2组幼虾少量的摄食能不足以满足正常生命活动需求和抵抗环境胁迫(药物、饥饿)，从而造成幼虾体质量迅速下降。

消化酶活性与水生动物的生长发育有着极其紧密的关系，是反映水生动物营养生理的重要指标，其活性变化可反映水生动物在环境中的生理状态和对环境的适应性[20-21]。研究证实，低浓度的丁草胺暴露对胡子鲶(Clariasfuscus)淀粉酶活性有一定的提高，脂肪酶活性随着暴露时间及浓度的增加显著降低[22]。本研究结果显示，丙草胺和丁草胺对克氏原螯虾消化酶活性产生了抑制作用，无诱导升高现象，且丙草胺对克氏原螯虾消化酶活性影响程度大于丁草胺。随着饥饿时间的延长，克氏原螯虾胃肠组织胃蛋白酶和肝胰脏脂肪酶活性呈逐渐降低的趋势，其胃肠淀粉酶活性则随饥饿时间的延长呈先升高后降低的趋势[23]。本研究结果显示，随着养殖时间的增加，丙草胺和丁草胺对克氏原螯虾幼虾消化酶活性的影响逐渐消失，后期幼虾消化酶活性变化可能是由于营养缺乏所致，与上述文献结果相似。

养殖水体环境多源性污染物对养殖对象健康存在较大威胁，微囊藻毒素[24]、硝态氮和氨态氮[25]和重金属离子[26]等均可诱导养殖对象产生强弱程度不一的氧化应激反应。SOD、CAT和MDA是几种经典的反映机体氧化胁迫状况的生理指标，被较多地应用在外源污染物对水生动物的氧化应激损伤研究中[27]。斑马鱼(Brachydaniorerio)暴露于丙草胺，其肝脏SOD、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性先诱导后抑制，CAT活性受到抑制，MDA含量升高[28]。毒死蜱对锯齿新米虾(Neocaridiandenticulate)的毒性显著高于Cu2+[29]，毒死蜱较低浓度组锯齿新米虾SOD表现为“抑制-诱导”的变化趋势，随着毒死蜱浓度增加，MDA含量呈逐渐上升的趋势[30]。本研究结果显示，丙草胺和丁草胺对克氏原螯虾幼虾抗氧化酶活性存在显著影响，SOD活性呈诱导-抑制变化规律，CAT活性与对照组无显著性差异，而MDA含量显著降低后与对照组无显著性差异，GPx活性呈诱导-抑制变化规律，随着养殖时间的增加，药物对其抗氧化酶活性的影响逐渐消失。魏华等[27]研究了溴氰菊酯对克氏原螯虾肝胰腺氧化胁迫效应，发现SOD和CAT活性呈抑制-诱导-抑制的变化规律，MDA含量则一直高于对照组。本研究结果与上述文献结果不尽相同，可能与试验过程中选取的药物种类、试验对象、取样时间节点以及药物毒性机理差异有关，但结果均表明所选药物对受试对象的抗氧化系统产生了显著影响。

表2 酰胺类除草剂对克氏原螯虾幼虾抗氧化酶活性的影响Table 2 Effects of amide herbicides on antioxidant enzyme activities of Procambarus crustacean juvenile

本研究结果表明，丙草胺组和丁草胺组克氏原螯虾抗氧化酶活性在第6天(除T-AOC外)和第17天(除GPx外)与对照组无显著性差异，而在第11天时，丙草胺组(MDA)和丁草胺组(GPx、CAT、T-AOC)抗氧化酶活性均显著高于对照组。研究证实，饥饿显著影响克氏原螯虾抗氧化酶活性[31]，因此，本文上述现象可能是由营养不足和药物双重胁迫因素累积叠加造成的，有待进一步验证。

稻田除草剂丙草胺和丁草胺可以诱导克氏原螯虾蜕壳，短时间内可以影响幼虾消化酶和抗氧化酶活性，幼虾体质量损失率增大，经短期少量投喂养殖后，负面效应逐渐消失。为避免饲料对试验结果的影响，本研究试验对象处于营养缺乏状态，对于正常投喂养殖条件下，丙草胺和丁草胺对幼虾生长发育是否仍存在上述影响，有待进一步研究和探索。