自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤在纳米氧化铝致斑马鱼幼鱼早期神经毒性中的作用

黄涛，王艳红，陈金，范蓉，尚楠，高晓诚，张兰，牛侨，张勤丽

山西医科大学公共卫生学院劳动卫生教研室，太原 030001

纳米材料是指结构单位的尺寸介于1～100 nm之间的超微粒材料[1]，具有体积效应、表面效应、量子尺寸效应和量子隧道效应等4个基本效应，使其在磁、光、电、生物和医学等各个领域均可发挥作用[2]。研究提示，纳米材料具有穿透血脑屏障[3]、血气屏障[4]和胎盘屏障[5]的能力，与同一物质的较大颗粒相比，它们具有更高的毒性潜能[6]，能在不同的器官和组织中积累并发挥其毒性作用[7]。纳米氧化铝(aluminum nanoparticles, AlNPs)占全球商业生产纳米颗粒市场的20%，广泛应用于医药、电子和化妆品等领域[8]。而中枢神经系统是AlNPs的潜在靶点，有研究表明，AlNPs可以通过血脑屏障进入大脑，损害动物的中枢神经系统，并且影响学习和记忆能力[9]。

自噬是普遍存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的细胞降解途径，是进行自我保护、维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定的重要机制。近年来，自噬作用正逐渐成为神经系统疾病研究中的热点，并且已被报道参与许多神经退行性疾病的病理变化，包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化症[10-11]。而自噬抑制剂又被认为是探究疾病与自噬相关性以及开拓疾病新的治疗措施的关键点[12]。自1982年Seglen和Gordon[13]首次发现3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3MA)可以作为自噬的抑制剂之后，3MA被广泛应用于自噬的机制研究。而纳米粒子是一类新型的自噬诱导剂，目前已有针对量子点、水溶性富勒烯、稀土金属氧化物等纳米材料诱导细胞自噬的研究[14]。本课题组前期的体外研究结果提示AlNPs致神经细胞死亡方式有凋亡、坏死和自噬，其中主要方式为自噬[15]，体内研究结果提示13 nm粒径的AlNPs对斑马鱼幼鱼早期的学习和记忆能力产生毒作用[16]，但其毒性机制尚不清楚。为进一步阐明AlNPs的毒作用机制，本研究加入自噬抑制剂后，采用形态学、行为学、生化指标以及基因改变相结合的方法，初步探讨自噬在AlNPs诱导的神经毒性中的作用。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试剂和仪器

1.1.1 主要试剂

13 nm粒径AlNPs(货号718475-100G)购自美国Sigma公司(分析纯)，3MA购自美国MCE公司(纯度：99.83%)，分析纯二甲基亚砜(DMSO)购自天津市恒兴试剂公司(中国)，超氧化物歧化酶(货号A001-3-2)试剂盒、乳酸脱氢酶(货号A020-2-2)试剂盒购自南京建成生物有限公司(中国)，BCA(bicinchonininc acid)蛋白定量(货号A045-4-2)试剂盒、超纯RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司(中国)，反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自普洛麦格生物技术有限公司(中国)，基因引物序列购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.1.2 主要仪器

SB25-12DTDN超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司，中国)，nano-ZS90纳米粒度仪(Malvern Panalytical，英国)，OLYMPUS BX51荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)，Image-pro plus图像分析软件(Media Cybernetics，美国)，EthoVison XT动物运动跟踪系统(Noldus Information Technology，荷兰)，DanioVision斑马鱼幼鱼行为轨迹跟踪系统(Noldus Information Technology，荷兰)，ZXSR-1090真彩触摸屏生化培养箱(上海智城，中国)，SpectraMaxM 2全自动酶标仪(美国Biotek Instruments公司)，QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，JEM-100CX透射电子显微镜(日本电子株式会社)。

1.2 纳米颗粒的表征

将AINPs溶于斑马鱼胚胎培养液(5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.33 mmol·L-1CaCl2和0.33 mmol·L-1MgSO4·7H2O，pH为7.2)，悬浊液经过30 min超声混匀后，吸取10 μL滴到有炭膜的铜网上，待铜网干燥后，在透射电镜(transmission electron microscope, TEM)下观察粒子分散情况，加速电压为80 kV。用图像分析软件对AINPs悬浊液的TEM结果进行平均粒径分析；在25 ℃左右，用纳米粒度仪检测超声混匀的AINPs悬浊液的Zeta电位。

1.3 神经毒性试验

1.3.1 实验动物及分组

选择健康野生型TU品系斑马鱼，购于武汉国家斑马鱼资源中心，饲养在斑马鱼养殖系统中。温度控制在28 ℃±0.2 ℃，光照周期为光照∶黑暗=14 h∶10 h，将pH调至7.2，电导率为500～550 μS·cm-1，每天规律喂食孵化出的丰年虾2次。实验前一天将亲鱼按比例(雌∶雄=1∶2)放入交配缸中，里面加入养殖系统中的水。第2天早晨拿走挡板，使雌鱼和雄鱼自然交配。将6 hpf(hours post-fertilizaiton)的鱼卵置于光学显微镜下观察，确定其发育阶段，并选择正常的胚胎分成4组，每组30颗置于6孔板，一共暴露6 d，每天更换溶液，每组设置3个平行。4组分别为对照组、3MA组、AlNPs组(100 mg·L-1)和AlNPs+3MA(用0.025%(V/V)的DMSO溶解3MA，3MA浓度为2.5 mmol·L-1)组，4组加入同等浓度的DMSO溶液。

1.3.2 斑马鱼幼鱼一般毒性试验

在6 hpf时开始进行暴露，分别在12、24、48、72、96、120和144 hpf记录斑马鱼卵和幼鱼的死亡数、孵化数和畸形数，并在显微镜下拍照。

1.3.3 行为学分析

黑暗状态下的运动行为及趋触性检测：将不同暴露组中的斑马鱼胚胎养至144 hpf，每个浓度组随机选取24条幼鱼放置到24孔板中，然后将24孔板放入Noldus幼鱼运动行为仪中，设置观察区域和检测程序，采集3 min的幼鱼运动视频。用EthoVision XT软件导出运动速度、移动距离和外圈累计时间百分比等参数，其中以外圈累积时间百分比为指标来表示幼鱼的趋触性程度[17]。

对强光刺激的惊恐逃避反射试验：将不同暴露组中的斑马鱼养至144 hpf，每个浓度组随机选择24条幼鱼放置到24孔板中，开启斑马鱼幼鱼行为轨迹跟踪系统，设置观察区域和检测程序，黑暗3 min-光照1 min-黑暗3 min。应用Ethovision XT软件导出各个时间段运动速度等参数。

1.4 氧化应激实验

收集144 hpf的30条斑马鱼幼鱼后用生理盐水制备匀浆上清液，BCA法进行蛋白定量，按试剂盒说明书测定组织超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性，重复测定3次。

1.5 荧光定量PCR检测

暴露结束后，每组取60条幼鱼置于2 mL的Ep管中，使用Trizol法提取斑马鱼RNA，再用反转录试剂盒合成cDNA，按照荧光定量PCR试剂盒的操作步骤进行基因定量。引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列信息Table 1 The sequence information of gene primer

1.6 统计学分析

2 结果(Results)

2.1 AlNPs的表征

如图1所示，AlNPs经超声混匀30 min后，13 nm粒径AlNPs在电子显微镜(×80 000)下没有明显的聚集，平均粒径为20.90 nm±9.51 nm。用纳米粒度仪检测纳米氧化铝平均水合粒径为86.89 nm±10.87 nm，平均Zeta电位是49.43 mV±2.21 mV。

2.2 斑马鱼幼鱼一般毒性试验

将6 hpf后的斑马鱼胚胎暴露于不同暴露组溶液中，统计各组胚胎144 hpf的孵化率、死亡率和畸形率。结果如表2所示，各组间的孵化率、死亡率和畸形率无统计学差异(P>0.05)。

由图2可知，对照组和3MA组的斑马鱼受精卵在12 hpf有明显的体节生成(图2(a)，红色箭头)，而AlNPs组和AlNPs+3MA组暴露12 hpf后出现发育迟缓现象，无明显的体节生成；在24 hpf，与对照组和3MA组相比，AlNPs组发育依然迟缓，AlNPs+3MA组明显好转，表现为明显的尾部延伸(图2(b)，蓝色箭头)，未见水肿或者固缩现象。其他时间段内未发现明显差异。

2.3 AlNPs暴露对幼鱼自发运动的影响

不同组幼鱼在144 hpf后的运动行为如图3所示。经单因素方差分析，对照组、3MA组、AlNPs组和AlNPs+3MA组平均速度不同，具有统计学意义(F=10.273,P<0.001)；移动距离不同，具有统计学意义(F=9.414,P<0.001)；趋触性能力不同，具有统计学意义(F=4.303,P=0.007)。AlNPs组与对照组、3MA组和AlNPs+3MA组相比，平均速度降低(P<0.001,P<0.001,P=0.001)，移动距离减少(P<0.001,P<0.001,P=0.001)，趋触性能力降低(P=0.002,P=0.005,P=0.034)。图4为幼鱼自发运动轨迹图，对照组与3MA组斑马鱼幼鱼运动轨迹规则，大多围绕孔板周围运动，而AlNPs组幼鱼运动轨迹杂乱，在孔板中做无规则运动。加入3MA后，平均速度和趋触性能力升高，移动距离增加，但运动轨迹依然比较杂乱。

图1 纳米氧化铝颗粒(AlNPs)溶液超声后透射电镜(TEM)下观察分散情况Fig. 1 Dispersion of alumina nanoparticles (AlNPs) solution under a transmission electron microscope (TEM) after sonication

表2 斑马鱼幼鱼孵化率、死亡率和畸形率Table 2 Hatching rate, mortality rate and deformity rate of zebrafish larvae

图2 不同时间段胚胎/幼鱼的形态学变化注：(a) 12 hpf；(b) 24 hpf；(c) 48 hpf；(d) 72 hpf；(e) 96 hpf；(f) 120 hpf；(g) 144 hpf；红色箭头标示体节；蓝色箭头标示尾部。Fig. 2 Morphological changes of embryos and larvae in different periods of timeNote: (a) 12 hpf; (b) 24 hpf; (c) 48 hpf; (d) 72 hpf; (e) 96 hpf; (f) 120 hpf; (g) 144 hpf; red arrow indicates somite; blue arrow indicates tail.

图3 斑马鱼幼鱼的运动行为及趋触性行为注：a表示与对照组相比，P<0.05；b表示与3MA组相比，P<0.05；c表示与AlNPs+3MA组相比，P<0.05。Fig. 3 The motor behavior and thigmotaxis of zebrafish larvaeNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with 3MA group, P<0.05; c, compared with AlNPs+3MA group, P<0.05.

图4 斑马鱼幼鱼自发运动行为轨迹图Fig. 4 Trajectory of spontaneous movement behavior of zebrafish larvae

2.4 AlNPs暴露对幼鱼惊恐逃避反射的影响

斑马鱼惊恐逃避反射实验结果(图5)表明，各组幼鱼在光照期的速度不同，具有统计学意义(F=5.249,P=0.003)，AlNPs组与对照组、3MA组和AlNPs+3MA组相比，速度明显降低，具有统计学意义(P=0.003,P=0.001,P=0.007)，提示加入3MA后减轻了AlNPs对斑马鱼应激能力的损伤。

图5 斑马鱼幼鱼光照惊恐逃避反射速度变化注：a表示与对照组相比，P<0.05；b表示与3MA组相比，P<0.05； c表示与AlNPs+3MA组相比，P<0.05。Fig. 5 Changes of panic escape reflex velocity of zebrafish larvae under illuminationNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with 3MA group, P<0.05; c, compared with AlNPs+3MA group, P<0.05.

2.5 斑马鱼幼鱼氧化应激水平

斑马鱼幼鱼的SOD活性如图6(a)所示，经单因素方差分析，对照组、3MA组、AlNPs组和AlNPs+3MA组的SOD活性不同，差异具有统计学意义(F=11.664,P=0.003)，与对照组、3MA组和AlNPs+3MA组相比，AlNPs组的SOD活性降低，具有统计学意义(P=0.001,P=0.007,P=0.001)。各组幼鱼的LDH活性如图6(b)所示，对照组、3MA组、AlNPs组和AlNPs+3MA组的LDH活性不同，差异具有统计学意义(F=5.760,P=0.011)。与对照组、3MA组和AlNPs+3MA组相比，AlNPs组的LDH活性升高，具有统计学意义(P=0.004,P=0.027,P=0.003)。

2.6 斑马鱼幼鱼自噬相关基因变化

荧光定量PCR结果显示，对照组、3MA组、AlNPs组和AlNPs+3MA组的beclin1基因表达差异有统计学意义(F=13.855,P=0.002)，与对照组、3MA组和AlNPs+3MA组相比，AlNPs组的beclin1基因表达升高(P<0.001,P=0.003,P=0.002)，如图7(a)所示；各组间vps34基因表达差异有统计学意义(F=15.477,P=0.001)，AlNPs组的vps34基因与对照组、3MA组和AlNPs+3MA组相比表达升高(P<0.001,P<0.001,P=0.002)，如图7(b)所示；各组间lc3Ⅱ基因表达差异有统计学差异(F=14.929,P=0.001)，AlNPs组的lc3Ⅱ基因较对照组、3MA组和AlNPs+3MA组表达升高(P<0.001,P=0.002,P=0.001)，如图7(c)所示。

图6 斑马鱼幼鱼氧化应激结果注：(a)超氧化物歧化酶(SOD)活性；(b)乳酸脱氢酶(LDH)活性；a表示与对照组相比，P<0.05；b表示与3MA组相比，P<0.05； c表示与AlNPs+3MA组相比，P<0.05。Fig. 6 Results of oxidative stress in zebrafish larvaeNote: (a) the activity of superoxide dismutase (SOD); (b) the activity of lactate dehydrogenase (LDH); a, compared with control group, P<0.05; b, compared with 3MA group, P<0.05; c, compared with AlNPs+3MA group, P<0.05.

图7 斑马鱼幼鱼体内自噬相关基因表达情况注：a表示与对照组相比，P<0.05；b表示与3MA组相比，P<0.05；c表示与AlNPs+3MA组相比，P<0.05。Fig. 7 Expression of autophagy related genes in zebrafish larvaeNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with 3MA group, P<0.05; c, compared with AlNPs+3MA group, P<0.05.

3 讨论(Discussion)

斑马鱼具有胚胎透明，胚胎早期发育快，易于大量获得样品，养殖花费少等优点，这使斑马鱼胚胎在评估纳米毒性方面具有更大的优势[18]。有研究表明，AlNPs可以穿透生物屏障，在多个器官中积累并导致神经毒性[19]、免疫毒性[20]和遗传毒性[21]。本课题组前期研究发现，AlNPs在体内外均可引起神经毒性[22-23]，然而对于AlNPs的神经毒性机制的研究还很有限。本实验以斑马鱼胚胎和幼鱼为研究对象，进一步阐明AlNPs的毒作用机制。

不同种类的纳米金属颗粒对于斑马鱼胚胎及幼鱼有着不同程度的影响，例如，纳米银暴露会导致斑马鱼存活率降低[24]，纳米二氧化钛暴露不仅导致显著的死亡率，还造成发育迟缓、畸形和DNA损伤[25]。本研究发现，暴露于AlNPs后，斑马鱼胚胎在12 hpf和24 hpf出现发育迟缓的现象，加入3MA后，在24 hpf情况明显好转。大多数胚胎在72 hpf左右孵化，各处理组间孵化率、死亡率和畸形率无显著性差异。

有研究表明，其他纳米颗粒对斑马鱼幼鱼存在神经毒性，行为评估主要研究幼鱼的运动行为，幼鱼的运动行为属于神经行为的研究范畴[26]。幼鱼在早期就可以表现出各种神经行为，如黑暗状态下的运动速度和移动距离，表现焦虑紧张的趋触性行为和先天具有的对强光刺激的惊恐反射[27]。本研究发现，AlNPs组幼鱼在黑暗状态下的运动速度、移动距离和趋触性反应明显降低，对强光刺激的惊恐反射能力和强光刺激后的黑暗逃避反射能力均下降，加入抑制剂3MA后，幼鱼的速度、移动距离、趋触性以及光刺激条件下的惊恐反射能力提高，提示AlNPs可能具有神经毒性，而3MA在一定程度上抑制了AlNPs的毒作用，对幼鱼的神经行为起到保护作用。

自噬是一个进化上高度保守的降解过程。在自噬过程中，细胞内容物被称为自噬小体的双膜囊泡吞噬，随后被传递到溶酶体进行降解[28]。有实验数据支持自噬和神经退行性疾病之间的直接联系[29]。自噬的发生依赖于一系列的自噬相关基因(autophagy related genes, Atg)，beclin1基因是酵母Atg6的同源基因，也是哺乳动物自噬的特异基因，而vps34作为Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的催化亚基，最初是在酵母突变体中发现的，也是酵母中唯一发现的PI3K[30]。Beclin1-vps34复合物是一种PI3K，被认为是自噬的正调节因子，主要参与自噬体形成的起始阶段。3MA是PI3K的抑制剂，通过抑制beclin1-vps34复合物的形成，来抑制胞浆可溶性形式lc3Ⅰ向自噬体膜结合形式lc3Ⅱ转化[12]。

自噬的目的是回收细胞成分和受损细胞器，以应对各种应激条件，越来越多的证据表明氧化应激是这些刺激的汇聚点[31]。氧化应激不仅是许多退行性神经疾病的早期特征[32]，而且是纳米颗粒发挥生物毒效应的重要机制[33]。SOD具有特殊的生理活性，是许多生物体内各种组织的主要自由基清除剂[34]。而LDH是细胞膜通透性的标志，在多种神经性疾病中发生改变，通过检测LDH的活性来评估细胞膜受损的程度[35]。本研究中发现AlNPs组斑马鱼体内SOD的活性降低，LDH的活性升高，表明AlNPs暴露可能导致氧化应激的发生。基因beclin1和vps34是自噬开始和进行的关键调节基因[36-37]，lc3Ⅱ是促进囊泡形成的必需物质[38]。本研究中发现beclin1、lc3Ⅱ和vps34的表达明显上调，表明斑马鱼体内神经细胞可能发生过度自噬导致幼鱼的神经行为受到损伤。加入自噬抑制剂3MA使得AlNPs对幼鱼氧化损伤减轻，自噬基因表达下调，提示自噬可能在AlNPs致斑马鱼幼鱼神经毒作用机制中有着重要的作用。

综上所述，斑马鱼幼鱼在早期神经发育阶段暴露于AlNPs可能通过诱导氧化应激和自噬的过度发生而导致神经毒性。自噬抑制剂3MA可以降低AlNPs所引起的氧化损伤，下调beclin1、lc3Ⅱ和vps34基因的表达，明显改善AlNPs暴露对幼鱼所致的早期神经毒性。