呼出气分析在肺炎病原体诊断中的研究进展

赵春秀，王晓龙

（重庆医科大学附属第二医院急救部，重庆 400010）

肺炎病原体的诊断一直是困扰临床的问题。 从下呼吸道痰标本培养到二代基因测序，均存在耗时、有创等问题。 呼出气分析因其无创、可重复、无需专业技术人员收集等优点，被广泛关注。 若能研发出快速、准确甄别各种病原体导致的肺部感染的呼出气检测系统，会有巨大应用前景。 然而，呼出气的成分复杂且微量，同时受口腔细菌、鼻腔细菌、饮食、运动、外界环境、收集分析技术等多种因素影响。 本文将对呼出气的收集方法、检测手段以及不同病原体呼出气可能的特异性成分的最新进展进行综述。

呼出气的收集方法

一、采样时机

理想收集物只包含由下呼吸道产生的呼出气，摒除空气和死腔气的干扰。收集的呼出气体分为混合性呼出气、呼气后期呼出气及肺泡呼出气。混合性呼出气没有采样时间的限制，操作简单，同时也存在包括环境气体和口鼻气污染等缺陷。呼气后期的呼出气摒除了呼气的前几秒（即死腔气），但可能会包含死腔气与肺泡气的混合气体。 肺泡呼出气是比较理想的呼出气样本，完全去除死腔气的影响，但如何控制刚好排除了死腔气，又尽量多地收集肺泡气是一个难题。一种简单的方法是使用Bio-VOC 针筒来收集，受试者只需通过一次性吹嘴向这种针筒缓慢匀速地吹气，收集到的呼气末呼出气可视为目标肺泡气。 同时，研究发现，利用压力传感器检测呼出气二氧化碳浓度，在到达平台期时启动采样，所得样本内源性物质浓度最高，这也是一种比较理想的呼出气收集方法[1]。

二、采样工具

机体呼出气通过化学捕集、吸附剂捕获和冷捕获等技术来采集，经预浓缩使目标化合物浓度达到分析仪器的检测阈值，再进行检测与数据处理。 分析前，呼出气样本多被储存在由惰性材料构成的聚合物袋（Tedlar 袋、铝袋、聚酯薄膜等），然后采用含吸附剂的热脱附（thermal desorption，TD）仪器、固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）器材或针刺捕集装置（needle trap device，NTD）对呼出气样本进行预浓缩。吸附剂作为TD 仪器进行预浓缩的关键材料，需要性质稳定，不与分析物相互作用。 Cheng 等[2]研发了一种由细菌和真菌细胞共同组成的新型生物吸附剂，吸附量稳定，对乙酸乙酯、α-蒎烯和正己烷的吸附性能明显优于其他吸附剂。Franchina等[3]对比了5 种吸附材料对细菌产生的挥发性有机化合物（volatile organic compound，VOC）吸附的灵敏度、重复性和选择性，结果发现Tenax 的采样性能最好，并且没有误判。

Tabibpour 等[4]发现用聚吡咯改造的碳纤维能够优化SPME 提取2-戊基呋喃（2-pentylfuran，2-PF）的性能，并在感染真菌患者与健康人的对照中发现健康人的呼出气中缺乏2-PF，从而认为2-PF 可能是呼吸中识别肺部真菌感染的挥发性生物标志物。利用NTD 技术在超痕量水平分析VOC 时，可以使用D-丙酮和D-甲苯作为吸附材料的内标志物，这种结果的可靠性更高[5]。

呼出气的检测

一、分析基质

呼出气的分析基质包括气相呼出气、 呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）和呼出气气溶胶（exhaled breath aerosols，EBA）。 气相呼出气包含大量VOC，受环境和体内微生物代谢等多种因素影响。 EBC 是呼出气体接触冷凝器发生冷却，以流体或冰冻形式收集而成，以水蒸气和被高度稀释的非挥发性化合物为主。EBC 中较大的分子，如细胞因子、蛋白质和病毒等，可以形成EBA，EBA 作为分析基质的优点在于无需经过冷凝，便可直接收集、滤过、运输，进行目标化合物分析。

二、分析方法

检测呼出气常用的方法包括气相色谱（gas chromatography，GC）检测、质谱检测（mass spectrometry，MS）和传感器检测。GC 是利用呼出气与色谱柱的固定相物质相互作用来鉴别呼出气的技术，MS 是根据VOC 产生的离子质荷比（m/z）对呼出气进行检测的技术，临床上多采用GC 和MS 联合应用，即GC-MS，这种方法提高了灵敏度和选择性，但存在设备体积庞大、价格昂贵、专业操作知识要求高和样品处理速度慢等缺点，且不能实现实时应用。 而质子转移反应质谱（proton transfer reactionmass spectrometry，PTR-MS）和选择离子流管质谱（selected flow tube-mass spectrometry，SIFT-MS）使在线实时分析成为可能。

传感器主要包括电子鼻和新型传感器。 电子鼻类同于动物嗅觉，通过识别呼出气特定的气味指纹，结合模式识别技术甄别疾病。 Chen 等[6]使用了电子鼻的8 种机器学习算法,将呼吸机相关性肺炎患者和健康人进行病例对照研究, 结果发现测试集的灵敏度为79%，特异度为83%，认为电子鼻可能是呼吸机相关性肺炎的诊断工具之一。

在新型传感器的发展方面，有研究发现，将半导体有机层与单壁碳纳米管（single walled carbon nanotube，SWCNT）结合在一起，能清晰展示呼出气指纹[7]。 Gouma 等[8]发现的新型异戊二烯传感器，是基于微系统的三代传感器阵列，能快速便捷地检测流行性感冒（流感）潜在的生物标志物。 Shen 等[9]首次证明了因抗体修饰的磁珠能够有效浓缩和纯化病毒，故硅纳米线传感器能够在几分钟内检测出EBC 样本中的流感病毒。Takenaka 等[10]发现利用一次性的生物气溶胶颗粒物传感系统，通过荧光染料标记EBA 颗粒，这种传感系统对操作人员要求不高、快速且准确，利于广泛应用。 近年来,有研究提出了可穿戴生物传感器这一概念，这种传感器能够实现实时、连续、动态与快速的检测，但目前相关研究较少。

不同肺炎呼出气可能的特异性成分

呼出气中不同疾病相关生物标志物的检测可以区分引起肺部感染的不同病原微生物[11]，也可细分病原体的不同亚型[12]，有助于疾病的诊断和分型，也有利于判断患者的预后。并且，一种病原体作用于机体会产生特异性的VOC，但不同病原体共同感染时释放的物质却不是简单相加，混合呼吸道感染时，不同病原体之间也存在相互作用[13]。

一、细菌

铜绿假单胞菌会释放一种“葡萄状”气味分子-2-氨基苯乙酮（2-aminoacetophenone，2-AA），患者感染该菌时，2-AA 的含量会明显升高。2-AA 可促进病原体表型变化，抑制病原体诱导的炎症，利于慢性或持续性感染，或许还能通过诱导氧化应激和骨骼肌凋亡延长感染病程[14]。感染该菌的细胞产生的多种挥发性代谢物在细菌的生长代谢过程中无显著差异，但耐药菌株和标准菌株产生的挥发性物质不同[15]。体内外细胞感染铜绿假单胞菌产生的挥发性代谢物也不同，这可能是该菌与体内支气管上皮细胞相互作用的结果[16]。 并且Koehler 等[17]发现体外铜绿假单胞菌DSM-50071 菌株在有氧和无氧条件产生的挥发性物质不一样，分别为1-十一烯和2-十一酮。Shestivska 等[18]培养了36 株不同基因型的铜绿假单胞菌，通过SPME-GC-MS和SIFT-MS 检测发现了硫氰酸甲酯。Montes Vidal 等[19]在革兰阳性棘孢小单孢菌和革兰阴性维罗纳假单胞菌的培养物中发现了一类新的挥发性化合物——长链脂肪腈。

Syhre 等[20]发现烟酸的衍生物（如烟酸甲酯）可能是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌产生的特异性挥发物，但烟草中也含烟酸，诊断时需排除吸烟的影响。Kolk 等[21]使用GC-MS 分析了南非肺结核患者50 例与非肺结核患者50 例，发现利用5-己酸、1-己醇、十四酸、辛醛等共同形成的VOC 谱在鉴别结核和非结核患者时灵敏度为72%，特异度为86%。 呼出气检测也可用于鉴别活动性与非活动性肺结核，活动性肺结核的生物标志物包括氧化应激产物（以烷烃及其衍生物为主）和结核分枝杆菌挥发性代谢物（环己烷和苯衍生物），在活动性肺结核中可以鉴定出1,3,5-三甲苯，而在非活动性阶段存在1,2,3,4-四甲苯[22]。

Neerincx 等[23]在体外研究发现，患者感染金黄色葡萄球菌后会出现1，4-戊二烯、乙醇、丙酮、2-丁酮、十一烷和2-甲基萘升高，3-羟基-2-丁酮、己醛和肉豆蔻酸异丙酯水平降低，但体外实验的结果可能与细菌和机体的实际相互作用结果存在差异。

二、真菌

倍半萜是侵袭性真菌感染患者呼出气中特有的挥发性物质，是C15H24类化合物，这种物质的代谢谱在体内外存在差异，对诊断体内感染具有重要意义[24]。 Bhimji 等[25]在感染侵袭性曲霉菌病免疫受损患者的EBC 中发现了半乳甘露聚糖（galactomannan，GM），这种物质参与曲霉菌细胞壁的构成。在肺曲霉菌的诊断方面，de Heer 等[26]发现使用Cyranose320 电子鼻检测侵袭性肺曲霉菌病定植于肺囊性纤维化患者的灵敏度为78%，特异度为94%，并且电子鼻在区分米曲霉和烟曲霉时，具有100%的准确度[27]。

三、病毒

Traxler 等[29]通过测量感染甲型流感猪的呼出气，发现有6 种VOC（乙醛、丙醛、乙酸正丙酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯和1，1-二丙氧基丙烷）可能与肺部疾病进展有关[28]。该团队在随后的一项体外培养实验发现，被甲型流感病毒感染的细胞产生的挥发性物质浓度与未被感染的细胞存在差异，当细胞进一步感染化脓性链球菌时，乙醛和丙醛释放增多。 最近的一项研究[30]也认为呼出气检测的诸多优点使其有望成为更便捷、更有效的检测新型冠状病毒的手段。

呼出气检测相较于血液、支气管肺泡灌洗液检验等有创技术，能够避免创伤、提高舒适度、减轻患者心理压力,具有良好的应用前景。 呼出气在线分析能减少传统呼吸采样过程中各种杂质的干扰，但吸入气体量、屏气时间、漱口和周围空气会显著影响在线分析的VOC 浓度。 由于呼出气检测暂无统一的实践标准，不同的呼出气收集方式、检测方法之间存在差异，无可比性，加之样本量不足，目前尚不能建立类似宏基因的数据库。 且诊断基于表型，不能完全替代传统培养技术、免疫学技术和基因检测技术，只能作为一种补充手段，或许将来能开发出一种呼出气快检试剂盒，利用试剂盒对肺炎病原体VOC 的高敏感性，初筛有肺炎可能的患者，再通过痰培养、二代基因测序等手段确定具体病原体种类。