骨关节炎大鼠膝关节软骨组织中BMAL1、PI3K/AKT信号通路因子表达变化

张晓冬，温亮

首都医科大学附属北京朝阳医院骨科，北京100020

骨关节炎(OA)是一种常见的关节退行性病变，发病率随年龄增长逐渐升高。目前OA仍以保守治疗为主，探索OA发病机制对OA的预防及治疗均有积极意义。生物钟基因及蛋白在生物界中普遍存在，其作用是调控昼夜节律运转。研究显示，OA患者软骨细胞存在生物钟紊乱的情况[1-2]，使得软骨细胞修复与磨损之间的平衡遭到破坏，从而诱发OA。孟庆军等[3]研究发现，OA大鼠软骨细胞生物钟BMAL1蛋白表达较正常大鼠显著降低；靶向Bmal1消融小鼠软骨细胞可消除其昼夜节律，导致关节软骨进行性退行性变。盐酸氨基葡萄糖是临床治疗OA的药物，以其作为本实验的干预药物，观察干预后对生物钟的影响。软骨细胞生物钟受何种信号通路调控目前尚不完全清楚。国外文献报道，生物钟可能与PI3K/AKT信号通路有关[4-5]。2020年6月—12月，我们观察了OA大鼠软骨组织生物钟BMAL1基因及蛋白的表达情况，以及PI3K/AKT信号通路分子的表达变化，旨在从新的角度阐述OA的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料 SPF级雄性SD大鼠24只，6周龄，体质量200～230 g，购自中国药品生物制品检定所。饲养于清洁级动物房，适应性喂养1周后用于实验。盐酸氨基葡萄糖购自北京康比得药业有限公司。HE染色试剂盒购自索莱宝公司。逆转录试剂盒购自美国Promega公司。Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自日本TOYOBO公司。Western blotting蛋白Marker购自美国Thermo Fisher公司。SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、蛋白上样缓冲液、ECL超敏发光液购自索莱宝公司。PI3K抗体、AKT抗体、BMAL1抗体、β-actin抗体购自英国Abcam公司。双人显微镜购自日本OLYMPUS公司。PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。电泳仪、酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 动物分组与干预 采用随机数表法将大鼠分为正常组、模型组、干预组，每组各8只。正常组不造模，给予生理盐水3 mL/d灌胃。模型组和干预组采用Hulth法制作OA模型[6]。以10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，手术部位备皮并消毒。在髌韧带处横向切约3 mm长的切口，将髌韧带切断，暴露关节腔内部。切断内侧副韧带，暴露半月板，用刀片取下内侧半月板。最后切断前后交叉韧带,缝合伤口。局部注射青霉素16万U/d防止伤口感染，连续注射3 d。模型组给予生理盐水3 mL/d灌胃。干预组给予盐酸氨基葡萄糖25 mg/(kg·d)灌胃。1次/天，连续28 d。

1.3 膝关节标本采集 最后一次给药后，将大鼠以10 %水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉，心脏取血6 mL，静置20 min后，1 700 r/min离心10 min，充分分离血清，将所得血清分装在EP管中，-80 ℃冰箱保存以备后续实验。膝关节取材在冰上完成，每组取2只大鼠膝关节置入4%甲醛溶液中固定，EDTA脱钙，每只大鼠关节可形成6张左右切片，用于组织病理检查；其余6只膝关节置于液氮中，-80 ℃冰箱保存，用于mRNA及蛋白检测。

1.4 膝关节软骨组织病理检查 采用HE染色法。大鼠膝关节置于EDTA饱和溶液中脱钙70 d，每周更换1次脱钙液。待针刺关节周围骨质可以刺入时，表明脱钙完毕。取出膝关节，石蜡包埋，切片，脱腊，进行HE染色，显微镜下观察。

1.5 膝关节软骨Mankin′s评分方法 取脱钙后的膝关节软骨切片，采用Safranin O染色，显微镜下观察软骨结构(规则程度、血管翳、裂隙)、软骨细胞数量(正常、增多、减少)、软骨潮线(潮线完整、血管穿过)、Safranin O染色情况(染色正常、染色轻中重度减弱、未显色)，以上述四个指标综合评分作为最终的Mankin′s评分[7]。

1.6 膝关节软骨组织中PI3K、AKT、BMAL1 mRNA检测 采用PCR法。取冻存的膝关节，用手术刀片刮下关节表面的软骨组织，加入液氮进行研磨。将研磨后的分成2份，分别用于基因和蛋白检测。使用RNA提取试剂盒提取组织软骨粉末中的RNA，逆转录合成cDNA。根据PCR试剂盒说明书构建反应体系，按照每组每个样本3个平行孔加样，使用PCR仪设定的模板反应体系进行扩增，扩增引物由广州复能公司Genecopoeia合成，引物序列见表1。从2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

表1 目的基因与内参基因引物序列

1.7 膝关节软骨组织中PI3K、AKT、BMAL1蛋白检测 采用Western blotting法。取研磨好的软骨粉末，加入RIPA裂解液裂解30 min，100 ℃水浴5 min。3 000 r/min离心3 min，取上清。采用BCA试剂盒测试提取蛋白浓度，配置成1 μg/μL的蛋白溶液，加入蛋白上样缓冲液后100 ℃煮沸5 min。将蛋白液加入凝胶板上的上样孔中，80 V通电30 min后转换成120 V，直至条带完全分散开后停止电泳。根据黑胶白膜原则进行转膜，脱脂牛奶封闭。PBS清洗，根据Marker标记进行裁剪并敷对应的一抗、二抗。使用ECL超敏发光液显色，读取条带灰度值,计算目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 三组膝关节软骨组织病理变化比较 正常组软骨具有一定厚度，表面光滑，潮线完整；模型组软骨厚度变薄，潮线不完整；干预组软骨厚度基本正常，潮线基本完整。

2.2 三组Mankin′s评分比较 正常组、模型组、干预组Mankin′s评分分别为(0.25±0.18)、(11.32±0.34)、(5.66±0.62)分。与正常组比较，模型组、干预组评分均升高；与模型组比较，干预组评分降低(P均<0.01)。

2.3 三组软骨组织中PI3K、AKT、BMAL1 mRNA表达比较 见表2。

表2 三组软骨组织中PI3K、AKT、BMAL1 mRNA表达比较

2.4 三组软骨组织中PI3K、AKT、BMAL1蛋白表达比较 见表3。

表3 三组软骨组织中PI3K、AKT、BMAL1蛋白表达比较

2.5 BMAL1表达与PI3K、AKT表达的相关性 BMAL1 mRNA表达与PI3K、AKT mRNA表达呈负相关(r分别为-0.432、-0.541，P均<0.05)，BMAL1蛋白表达与PI3K、AKT蛋白表达也呈负相关(r分别为-0.313、-0.415，P均<0.05)。

3 讨论

生物钟普遍存在于哺乳动物体内，它是由神经内分泌系统和基因时序震荡表达所形成的体系，使得生物从微观的基因蛋白层面到宏观的昼夜更替都具备了生物节律性[8-9]。在生物钟系统中存在着两个闭合的环路，分别是BMAL1、CLOCK和PER1、CRY1，其中由BMAL1、CLOCK基因及蛋白组成的环路对生物钟起激活作用，而PER1、CRY1基因及蛋白组成的环路则相反[10]。PI3K/PTEN/mTOR有mTORC1和mTORC2两种复合物，二者通过对细胞内外各种刺激进行接受和整合从而调控多种疾病的发生发展。研究发现，OA的发病与软骨细胞生物钟蛋白BMAL1表达缺失有关[11-13]。国外有文献报道，生物钟可能与PI3K/AKT信号通路相关[4-5，14]。本研究通过制备OA模型，以盐酸氨基葡萄糖作为OA的阳性治疗药物进行干预，观察在正常情况、OA情况及阳性药物干预下，大鼠关节软骨细胞生物钟BMAL1基因及蛋白的变化以及PI3K/AKT信号通路因子的表达变化。

关节软骨由软骨基质和软骨细胞组成，软骨表面的局灶损伤是OA发生的开始，进而出现软骨基质代谢紊乱，最后发展成更大范围的软骨破坏[15-16]。本研究采用Hulth法制作OA模型，结果显示，OA大鼠关节软骨表面不光滑，HE染色可见软骨变薄，潮线不完整，Mankin′s评分较高，表明存在明显的骨破坏，此表现与OA的病理表现一致，证明Hulth法可成功复制OA模型。盐酸氨基葡萄糖是目前临床治疗OA的常用药物，其作用原理是基质胶原网架上附着盐酸氨基葡萄糖形成的蛋白聚糖胶体复合物，增加胶原网架的弹性，可承载压力并缓冲应力，从而起到保护软骨和软骨下骨的作用。本研究结果显示，干预组给予盐酸氨基葡萄糖后，软骨表面较模型组光滑，且Mankin′s评分下降，表明盐酸氨基葡萄糖对OA大鼠具有治疗作用。

哺乳动物的生物钟受中枢及外周生物钟的调控。中枢生物钟位于下丘脑视交叉上核(SCN)，SCN可自主产生生物节律，并通过调控生物钟环路维持人体的生物节律，如睡眠、内分泌、体温等。外周生物钟则存在于身体的各个外周组织当中，如骨关软骨、心脏、肌肉等，外周生物钟不同于中枢生物钟，其不具备产生自主节律的功能，节律的产生受SCN的调控。在生物钟系统中，BMAL1是重要的信号元件，它起到了激活生物钟环路的作用。软骨细胞生物钟属于外周生物钟，受控于SCN，当软骨细胞中生物钟关键元件BMAL1减少时，软骨细胞生物节律表达受到抑制，因此难以维持“休息时软骨细胞的修复”与“运动时软骨细胞的磨损”之间的节律与平衡。使用药物干预后，BMAL1表达有所增加，故可以维持该平衡。本研究结果显示，模型组软骨细胞生物钟基因BMAL1 mRNA及蛋白表达下降，表明OA的发生伴随着软骨细胞生物钟的紊乱，生物钟系统中起激活作用的环路基因及蛋白表达受到抑制；干预组BMAL1 mRNA及蛋白表达均不同程度增高，表明盐酸氨基葡萄糖对于恢复软骨细胞生物钟的平衡有一定作用，提示治疗OA的药物可能通过调控生物钟的表达进而缓解OA症状，进一步验证了BMAL1在OA发病中的作用。

软骨细胞中的PI3K、AKT mRNA及蛋白表达均显著升高，表明OA的发生伴随着PI3K/AKT信号通路的激活。本研究结果显示，模型组PI3K/AKT通路相关基因PI3K、AKT mRNA及蛋白表达上调，表明PI3K/AKT通路处于激活状态，同时伴随着BMAL1基因及蛋白表达的下降；干预组PI3K、AKT mRNA及蛋白表达不同程度下调，表明PI3K/AKT通路受到抑制，同时伴随着BMAL1基因及蛋白表达增高。相关性分析结果显示，BMAL1表达与PI3K/AKT表达呈负相关，提示PI3K/AKT信号通路的激活可能下调BMAL1基因及蛋白的表达。

综上所述，OA大鼠膝关节软骨组织中起生物钟激活作用的BMAL1表达量下降；OA大鼠PI3K/AKT信号通路呈激活状态，可降低BMAL1表达。PI3K/AKT信号通路与生物钟的靶向调控关系，有待后续实验验证。