miR-106a-5p靶向STAT3抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭的机制

周辉 李睿春 颜大钧 蔡东鹏 吴文佼 钟德泉 姜晓丹

1南方医科大学珠江医院神经外科，国家临床重点专科，脑血管病诊断与治疗教育部工程研究中心，广东省普通高校脑功能修复与再生重点实验室，广东神经外科研究所（广州 510282）；2 广东药科大学附属第一医院神经外科（广州 510080）

胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤之一，约占原发颅内肿瘤的50%左右，具有发病率、病死率高等特点［1］。治疗以手术联合放化疗为主，但往往由于胶质瘤边界不清，呈侵袭性生长，手术难以完全切除，术后易复发，预后极差。因此，关于胶质瘤复发机制的研究成为近年来关注的热点［2］。微小核糖核酸（miRNA）参与细胞分化、增殖、代谢、信号转导等生物过程［3-5］。据报道［6-7］，miR-106a-5p能抑制乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞的增殖和侵袭，并且可作为胶质母细胞瘤患者的独立预后预测指标［8］，但其对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响尚不清楚，本实验拟研究miR-106a-5p 在胶质瘤细胞的增殖和侵袭中的作用机制，为防治胶质瘤的复发提供一种新的靶点。

1 材料与方法

1.1 标本材料

1.1.1 样本来源收集广东药科大学附属第一医院神经外科2017年1月至2020年12月间接受再次手术治疗的15 例复发胶质瘤患者的肿瘤标本，其中5 例取自癌旁组织（距肿瘤增强灶边缘＞1.5 cm）。纳入标准：患者第一次手术病理报告为胶质瘤（WHO 分级Ⅰ～Ⅳ级均可）；年龄＞18 岁，自愿接受再次手术；无明显手术禁忌证。排除标准：心、肝、肾等器官功能障碍；凝血功能异常。本项目得到我院医院伦理委员会审核（医伦审［2017］第（76）号），参与研究的所有患者均已签署知情同意书。

1.1.2 病例资料患者年龄37 ～64 岁，平均（50.12 ± 7.58）岁；男9 例，女6 例。临床症状：头痛、恶心呕吐10 例，偏瘫或失语4 例，癫痫1 例。病变位置：额叶7 例，颞叶3 例，顶叶3 例，枕叶2 例；肿瘤直径＜5 cm 10 例、≥5 cm 5 例；第一次手术后病理类型：Ⅰ～Ⅱ级2 例，Ⅲ～Ⅳ级13 例；第一次术后患者KPS 评分60 ～90 分。复发时间4 ～26个月，平均（15.87±6.93）个月。5 例癌旁组织取自额叶肿瘤旁。

1.2 细胞培养小鼠神经元细胞及胶质瘤细胞株GL261（赛百慷，上海），正常培养体系：95%DMEM+ 5%胎牛血清（Gibco，美国）+ NGF 20 ng/mL（Affinity，美国）+谷氨酰胺100 μg/mL。

1.3 主要试剂与仪器荧光染料SYBR Green I（Invitrogen，美国），引物序列设计、慢病毒包装及表达载体构建（锐博生物，广州），Trizol 试剂盒（Sigma，美国），逆转录试剂盒（Vazyme Biotech，美国），LipofectamineTM2000 转染试剂盒（Invitrogen，美国），一抗STAT3 蛋白（信号转导与转录激活因子-3）、BAX 蛋白（Bcl-2 关联X 蛋白）、cl-caspase-3蛋白（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3）以及p21 蛋白（Affinity，美国）。Transwell 细胞培养皿（Gibco，美国），紫外可见分光光谱仪（Thermo，美国），定量PCR 仪（StepOnePlus™，美国）。

1.4 方法

1.4.1 qPCR 检测细胞中miR-106a-5p 和STAT3水平提取细胞总RNA（Trizol 法）并测定纯度和浓度，按逆转录试剂盒逆转录。SYBR Green 染料法进行定量PCR，反应条件：95 ℃下使模板DNA变性30 s →55 ℃下退火30 s →72 ℃延伸60 s，循环30 次。最后在72 ℃下扩展10 min，收集荧光信号。各样品重复3 次。内参为GAPDH，使用2-ΔΔCT法计算miR-106a-5p 和STAT3 的相对表达量。引物序列见表1。

1.4.2 细胞转染与分组将GL261 细胞按按105/mL 接种于6 孔板中，分别转染构建的miRNA-NC mimics、miR-106a-5p mimics、miR-106a-5p inhibitor质粒（锐博生物，广州）24 h，并对应分组，正常的GL261 为Control 组。具体转染步骤参照LipofectamineTM2000 试剂盒进行。

1.4.3 蛋白质印迹（WB）检测各组细胞凋亡相关分子表达将各组细胞置于冰上，裂解1 h 后提取总蛋白（RIPA 法），检测蛋白浓度（BCA 法），每孔上样50 μg。配置10%分离胶（SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒），140 V 电压电泳1.5 h。按分子量切取相应目的条带，电转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶封闭1 h。滴加相应兔抗小鼠STAT3、BAX、cl-caspase-3、p21 一抗（1∶1 000），并在4 ℃孵育过夜。用1×TBST 洗膜3 次，次日滴加山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000），室温孵育1 h。洗膜3 次。增强化学发光法（ECL）显影。选择GADPH 作为内参，用Image J 软件测定目的蛋白灰度值，按目的蛋白灰度值除以GADPH 灰度值计算其相对表达量。

1.4.4 TargetScan 预测和双荧光素酶报告确定miR-106a-5p和STAT3的关系借助在线生物信息分析软件TargetScan7.1（http：//www.targetscan.org/），预测出STAT3 是miR-106a-5p 的靶基因之一。再利用双荧光素酶基因报告实验验证二者间的靶向关系；依据预测的可能结合位点，分别构建包含该位点（Wt）和突变位点（Mut）的DNA 片段（锐博生物，广州）；并将其与miR-106a-5p 共转染至GL261 中培养48 h，最后测定荧光素酶的活性。

1.4.5 CCK-8 实验测定过表达miR-106a-5p 在GL261 增殖中的作用在96 孔板中按适当密度接种转染miR-106a-5p mimics 的GL261，培养基每2天更换一次。并在12、24、48、72 h查看细胞状态，然后各孔添加CCK-8 溶液10 μL 后孵育4 h，使用酶标仪测定450 nm 处各孔细胞的吸光值（A450），绘制增殖率曲线，细胞增殖率=（A实验-A空白）/A空白×100%。

1.4.6 Transwell 实验测定miR-106a-5p mimics 对GL261 侵袭力的作用先在Transwell 培养皿内室中铺上新鲜制备的Matrigel 基质胶，37 ℃干燥2 h。再将转染miR-106a-5p mimics 的GL261 细胞接种于Transwell 的内室，在下室中加入DMEM 培养基（含20%胎牛血清）500 μL，置于37 ℃、5%CO2恒温细胞培养箱中，培养2 d 后轻轻擦去内室底部Matrigel 胶和未侵袭的GL261 细胞，多聚甲醛固定30 min，DAPI 室温下染色30 min，在显微镜高倍视野下对细胞进行拍照和计数。

1.5 统计学方法对实验数据采用SPSS 20.0（IBM，美国）进行统计处理，计量数据若符合正态分布，以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK 方法；若是偏态分布时，采用非参数秩和检验。计数变量采用例数和百分数表示，比较采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-106a-5p 在人复发胶质瘤组织和GL261细胞中的水平qPCR 结果显示，在人复发胶质瘤组织中，miR-106a-5p 水平明显少于周围癌旁组织（P＜0.01）。在GL261 胶质瘤细胞中的水平也显著低于正常神经细胞（P＜0.05），见图1。

图1 人复发胶质瘤组织和GL261 中miR-106a-5p 的水平Fig.1 The levels of miR-106a-5p in human recurrent glioma and GL261

2.2 转染miR-106a-5p 模拟物的GL261 中STAT3的表达水平相比Control 组，转染了miR-106a-5p mimics 质粒的GL261，miR-106a-5p 的水平明显升高（P＜0.01），同时STAT3 的表达水平显著下调（P＜0.01）；在miR-106a-5p inhibitor组中，miR-106a-5p 水平明显降低（P＜0.01），STAT3 的表达显著上调（P＜0.01）。

图2 miR-106a-5p 的表达对GL261 中miR-106a-5p 和STAT3 的影响Fig.2 Expression of miR-106a-5p affects the levels of miR-106a-5p and STAT3 in GL261

2.3 双荧光素酶验证miR-106a-5p 和STAT3 的靶向关系TargetScan 在线数据库预测miR-106a-5p与STAT3 的3′UTR 存在部分结合位点（图3A），预测miR-106a 对STAT3 的表达具有一定调控作用。在双荧光素酶基因报告中，显示共转染STAT3-WT野生型和miR-106a-5p mimics 的细胞中荧光素酶活性明显降低（P＜0.01，图3B），验证了miR-106a-5p 与STAT3 之间存在着互为靶向的关系。

图3 预测和验证miR-106a-5p 与STAT3 间的相互关系Fig.3 Predict and verify the relationship between miR-106a-5p and STAT3

2.4 过表达miR-106a-5p 对GL261 细胞增殖和侵袭的影响CCK-8 和Transwell 结果显示，相比Control 组，miR-106a-5p mimics 组GL261 细胞增殖数量明显减少（P＜0.05，图4A），细胞侵袭能力也显著下降（P＜0.01，图4B）。

图4 过表达的miR-106a-5p、在GL261 增殖与侵袭中的作用（×400）Fig.4 Over-expression of miR-106a-5p affects on proliferation and invasion in GL261（×400）

2.5 蛋白质印迹检测各组GL261 中相关凋亡分子的表达蛋白质印迹结果显示，与Control 组相比，miR-106a-5p mimics 组STAT3 的表达显著下降（P＜0.01），但BAX、cl-caspase-3 及p21 的表达显著上升（P＜0.01）；miR-106a-5p inhibitor 组STAT3 表达显著升高（P＜0.01），BAX、cl-caspase-3 及p21 的表达显著下降（P＜0.05），见图5。

图5 miR-106a-5p 对GL261 中BAX、cl-caspase-3 和p21 水平的作用Fig.5 The levels of Bax,cl-caspase-3 and p21 in GL261 were affected by mir-106a

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统最常见的一类恶性肿瘤，约占颅内原发肿瘤的50%左右，预后极差，其中高级别胶质瘤患者的平均生存期仅有12 ～15 个月［1］。如何延长胶质瘤的复发时间，提高患者生存时间，成为胶质瘤研究的核心。目前，手术的切除程度、术后放化疗或其他新兴分子靶向药物等是研究控制胶质瘤复发的主要方向［9］。以往很多研究发现miRNA 可以通过介导调控靶基因的表达参与多中癌症的发生发展及复发，本团队以往也证实miR-107 参与胶质瘤干细胞的生长和侵袭［10］，但鲜有报道miRNA 的异常表达在胶质瘤复发中发挥作用的机制。有学者证实，miR-106a-5p是多种肿瘤潜在的抑癌基因，并且可以作为一个独立的标记物对胶质瘤患者治疗效果和预后进行评价［6-9］。然而其在胶质瘤，尤其在复发胶质瘤中的生物特性及作用机制尚未明确。本研究中首次收集15 例复发胶质瘤患者再次手术切除的肿瘤组织与5 例癌旁组织样本，通过qPCR 检测miR-106a-5p 的水平，发现miR-106a-5p 在复发胶质瘤组织中的表达水平明显低于癌旁组织，与文献报道［10］的在原发胶质瘤中低表达一致，表明miR-106a-5p 也可以作为抑制复发胶质瘤生长的一个潜在靶点。

STAT3 是细胞内广泛存在的信号转录因子家族之一，被认为是促癌基因，参与多种肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭与凋亡［11］。有学者发现STAT3在肾癌细胞中高表达，通过抑制STAT3 的激活来抑制肾癌细胞增殖与侵袭［12］。在胶质瘤细胞中STAT3 也明显增强，抑制JAK2/STAT3 信号通路也能够显著抑制胶质瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡［13］。因此在本研究将miR-106a-5p 模拟物转染至小鼠胶质瘤细胞株GL261 中，观察二者之间的表达量的关系，发现miR-106a-5p 负调控STAT3 的表达。接着通过TargetScan 生物在线软件预测了STAT3 就是miR-106a-5p 的靶基因，进一步双荧光素酶基因报告证实了它们二者之间的相互作用。结果显示，过表达miR-106a-5p 可下调STAT3 的水平，同时过表达miR-106a-5p 可以下调GL261 细胞的增殖和侵袭能力，表明STAT3 是miR-106a-5p 的下游靶基因。

以往研究显示，STAT3 激活可以干扰肿瘤细胞的凋亡，通过上调p21、cl-caspase-3 的表达促进肾癌细胞的凋亡，同时STAT3 也参与BAX、cl-caspase-3、p21 等蛋白的表达［14-15］。在LIAO 等［16］的实验中，阻断STAT3 在肿瘤组织中的激活，增加了BAX、p21 的水平，下调Bcl-2 的表达，进而诱导癌细胞凋亡，降低了肿瘤体积和肿瘤质量。其中BAX、cl-caspase-3 是凋亡相关因子［17-18］，p21 是周期蛋白依赖激酶抑制基因［19］，在细胞的凋亡过程中也发挥着重要作用。本研究结果也显示，miR-106a-5p 的过表达在下调STAT3 表达的过程中，也升高了BAX、cl-caspase-3 和p21 的表达水平，有可能通过调控肿瘤细胞的凋亡来抑制胶质瘤的生长，有待以后进一步的研究。

综上，miR-106a-5p 低表达于人复发胶质组织和胶质瘤细胞中，过表达miR-106a-5p 可抑制胶质瘤细胞中STAT3 的表达，减弱胶质瘤细胞的增殖与侵袭能力，同时促进细胞凋亡相关因子BAX、clcas-pase-3 及抑癌基因p21 的表达，为防治胶质瘤的复发提供了一个新的靶点。