circPTPRA靶向miR-556-3p对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的影响

白文辉 李英 李宗龙

青海红十字医院乳腺外科（西宁 810000）

乳腺癌严重威胁女性生命健康，其发生发展是多因素共同作用的结果［1-3］，探究乳腺癌中异常表达的基因及其对该肿瘤发展的影响，可为其治疗提供新策略。circPTPRA是一种在肺癌中表达下调的环状RNA（circular RNA，circRNA），上调其表达可阻碍肺癌细胞上皮间质转化，降低小鼠异种移植瘤转移，抑制肺癌发展进程［4］。然而，circPTPRA 对乳腺癌发生发展的影响还未知。StarBase生物在线软件预测显示，circPTPRA 与miR-556-3p之间可能存在靶向调控关系。有报道称，miR-556-3p 在膀胱癌中表达升高，上调miR-556-3p 可促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和集落形成［5］。但是，miR-556-3p 对乳腺癌发生发展的影响尚不明确。本研究主要观察circPTPRA 和miR-556-3p 对乳腺癌细胞MDA-MB-231 增殖、迁移和侵袭的影响及circPTPRA 能否靶向miR-556-3p 发挥作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料选择2015年10月至2018年5月于本院行手术治疗的41 例乳腺癌患者为研究对象，患者平均年龄（53.26±8.75）岁；TNM 分期Ⅰ期9 例，Ⅱ期17 例，Ⅲ期15 例；依据病理类型不同分为导管原位癌（8 例）、浸润性导管癌（28 例）和浸润性小叶癌（5 例）。纳入标准：首次确诊；术前未行任何治疗；经病理检查确诊。排除标准：同时患有其他肿瘤；自身免疫疾病、血液系统疾病等患者。研究符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 细胞和试剂MDA-MB-231 细胞株，中国科学院上海细胞库；RPMI 1640 培养基、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）和双荧光素酶活性检测试剂盒，北京索莱宝；胎牛血清，美国Hyclone 公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物、circPTPRA 过表达载体（pcDNAcircPTPRA）、空载体（pcDNA）、miR-556-3p 抑制剂（anti-miR-556-3p）和模拟物（mimcs）、抑制剂阴性序列（anti-miR-NC）及模拟对照序列（miR-NC），上海生工；RNA 抽提试剂盒、逆转录试剂盒和PCR 试剂盒，大连宝生物；LipofectamineTM2000 试剂盒，美国Invitrogen 公司。

1.3 方法

1.3.1 实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测circPTPRA 和miR-556-3p 表达充分研磨组织样本，用RNA 抽提试剂盒提取组织中总RNA，逆转录为cDNA 后，行PCR 扩增。2-△△Ct法计算circPTPRA、miR-556-3p的表达量。

1.3.2 细胞培养和转染用含10 %胎牛血清的RPMI 1640 培养基（完全培养基）培养MDA-MB-231 细胞。取6 孔板，接种MDA-MB-231 细胞（1×105个/孔），培养12 h 后，弃培养基。将LipofectamineTM2000 试剂与等体积终浓度为100 nmol/L 的pcDNA（pcDNA 组）、pcDNA-circPTPRA（pcDNA-circPTPRA 组）、anti-miR-NC（anti-miR-NC 组）、antimiR-556-3p（anti-miR-556-3p 组）、pcDNA-circPTPRA 与miR-NC（pcDNA-circPTPRA+miR-NC 组）、或pcDNA-circPTPRA 与miR-556-3p mimics（pcDNAcircPTPRA+miR-556-3p 组）混合均匀，缓慢加至6 孔板中。孵育6 h 后，换为完全培养基。再培养24 h，收集细胞用于后续实验。

1.3.3 CCK-8 法检测细胞增殖取96 孔板，接种各组细胞（1.0×104个/孔）。培养24 h，加10 μL CCK-8。孵育2 h，酶标仪450 nm 处测光密度（OD）值。

1.3.4 Transwell检测细胞迁移和侵袭迁移实验：于Transwell 上室接种各组细胞（1.0×104个/室），下室加500 μL 完全培养基。培养24 h，弃培养基，经多聚甲醛固定、结晶紫染色后，显微镜观察，记数。侵袭实验：除预先在Transwell 上室铺Matrigel基质胶外其余步骤同迁移实验。

1.3.5 双荧光素酶报告基因实验由上海生工根据StarBase 生物在线软件预测显示的circPTPRA 与miR-556-3p 的结合位点，分别构建circPTPRA 野生型荧光素酶载体（WT-circPTPRA）及突变型荧光素酶载体（MUT-circPTPRA）。取6 孔板，接种MDAMB-231 细胞（1×105个/孔），培养12 h 后，弃培养基。将LipofectamineTM2000 试剂与等体积终浓度为100 nmol/L 的WT-circPTPRA 与miR-556-3p mimics、WT-circPTPRA 与miR-NC、MUT-circPTPRA 与miR-556-3p mimics 或MUT-circPTPRA 与miR-NC 混合均匀，缓慢加至6 孔板中。孵育6 h 后，换为完全培养基。再培养24 h，弃培养基，裂解细胞。将裂解液离心（3 500 r/min、5 min）后，取上清，检测荧光素酶活性，结果以萤火虫与海肾的荧光强度比值表示。

1.4 统计学方法SPSS 22.0 软件分析数据。计量资料以均数±标准差表示。两组间比较用独立样本t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circPTPRA 和miR-556-3p 在乳腺癌组织中的表达乳腺癌组织中circPTPRA 表达低于癌旁组织（P＜0.05），miR-556-3p 表达高于癌旁组织（P＜0.05），这说明circPTPRA 在乳腺癌组织中表达上调，miR-556-3p 表达下调。见图1。

图1 circPTPRA 和miR-556-3p 在乳腺癌组织中的表达Fig.1 The expression of circPTPRA and miR-556-3p in breast cancer tissues

2.2 过表达circPTPRA 抑制乳腺细胞增殖与pcDNA 组比较，pcDNA-circPTPRA 组MDA-MB-231细胞中circPTPRA 表达升高（P＜0.05），OD值降低（P＜0.05），说明过表达circPTPRA 可阻碍MDAMB-231 细胞增殖。见图2。

图2 过表达circPTPRA 对MDA-MB-231 细胞增殖的影响Fig.2 The effect of overexpression of circPTPRA on the proliferation of MDA-MB-231 cells

2.3 过表达circPTPRA 抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭与pcDNA 组比较，pcDNA-circPTPRA 组MDAMB-231 细胞迁移和侵袭数降低（P＜0.05），说明过表达circPTPRA 可阻碍MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭。见图3。

图3 过表达circPTPRA 对MDA-MB-231 细胞迁移和侵袭的影响Fig.3 The effect of overexpression of circPTPRA on the migration and invasion of MDA-MB-231 cells

2.4 circPTPRA 靶向调控miR-556-3p 的表达共转染WT-circPTPRA 与miR-556-3p mimics 的细胞荧光素酶活性为（0.55±0.05），明显低于共转染WT-circPTPRA 与miR-NC 的细胞荧光素酶［（1.01±0.08），t=14.628，P＜0.05］；共转染MUT-circPTPRA与miR-556-3p mimics 的细胞荧光素酶活性为（1.02± 0.06），与共转染MUT-circPTPRA 与miR-NC 的细胞荧光素酶比较差异无统计学意义［（1.04±0.04），t=0.832，P=0.418］，说明circPTPRA 可靶向结合miR-556-3p。pcDNA-circPTPRA组MDA-MB-231细胞中miR-556-3p表达量低于pcDNA组［（0.47±0.04）vs.（1.00±0.04），t=28.107，P＜0.05］，说明过表达circPTPRA 抑制miR-556-3p 表达。

2.5 敲减miR-556-3p 抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭anti-miR-556-3p 组MDAMB-231 细胞中miR-556-3p 表达、细胞OD值、迁移和侵袭数低于anti-miR-NC 组（P＜0.05），说明敲减miR-556-3p 可阻碍MDA-MB-231 细胞增殖、迁移和侵袭。见图4。

图4 敲减miR-556-3p 对MDA-MB-231 细胞增殖、迁移和侵袭的影响Fig.4 The effect of knocking down miR-556-3p on the proliferation，migration and invasion of MDA-MB-231 cells

2.6 过表达miR-556-3p 逆转过表达circPTPRA对乳腺癌MDA-MB-231 细胞增殖、迁移和侵袭的影响pcDNA-circPTPRA+miR-556-3p 组MDA-MB-231 细胞中miR-556-3p 表达、细胞OD值、迁移和侵袭数均高于pcDNA-circPTPRA+miR-NC 组（P＜0.05），说明过表达miR-556-3p 逆转了过表达circPTPRA 对MDA-MB-231 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。见图5。

图5 过表达miR-556-3p 逆转过表达circPTPRA 对MDA-MB-231 细胞增殖、迁移和侵袭的影响Fig.5 Overexpression of miR-556-3p reversed the effect of overexpression of circPTPRA on the proliferation，migration and invasion of MDA-MB-231 cells

3 讨论

circRNA 呈闭合环状结构，结构稳定，且高度保守。近年来，随着高通量测序技术的发展，发现肺癌、胃癌、结肠癌等肿瘤中存在大量异常表达的circRNA，这些circRNA 参与调控肿瘤细胞恶性表型，为肿瘤治疗提供了潜在分子靶点［6-8］。研究已表明，多种circRNA 参与乳腺癌的发展进程，其中circAHNAK1、circAMOTL1、circNFIC 和circKDM4C等circRNA 在乳腺癌中表达下调，对乳腺癌发展起抑制作用［9-12］；circ_0067934、circRNA-CER、circ-MMP11 和circ_100876 等［13-16］在乳腺癌中表达上调，作为促癌基因促进乳腺癌的发展进程。作为一种circRNA，circPTPRA 在膀胱癌组织中表达降低，且其低表达与肿瘤分期、肿瘤大小及预后密切相关，上调其表达可减弱膀胱癌细胞的增殖能力，可作为膀胱癌的预后生物标志物和治疗靶标［17］。本研究显示，乳腺癌组织中circPTPRA 的表达明显低于癌旁组织，提示circPTPRA 可能在乳腺癌中也发挥抑癌基因作用；过表达circPTPRA 抑制了乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示circPTPRA也可作为乳腺癌治疗的分子靶点。

circRNA 可发挥miRNA 分子海绵作用调控miRNA靶基因表达，进而发挥生物学调控作用［18-20］。为了探究circPTPRA 影响乳腺癌发生发展的调控机制，本研究证实了circPTPRA 可靶向结合并负调控miR-556-3p，这与本文结果中乳腺癌组织中circPTPRA 表达降低而miR-556-3p 表达升高的结果一致。研究显示，miR-556-3p 在食管癌组织中呈高表达，且其高表达的患者预后较差，过表达miR-556-3p 阻碍食管癌细胞增殖和侵袭，为食管癌的治疗提供了新的治疗靶标［21］；miR-556-3p在肺癌中表达下调，上调miR-556-3p 可延缓肺癌发展进程，并增强肺癌细胞对顺铂的敏感性［22］。这提示miR-556-3p 可能在不同肿瘤中发挥的作用不同。本研究显示，敲减miR-556-3p可有效阻碍乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，提示miR-556-3p 可能对乳腺癌发展起促进作用，靶向下调其表达可抑制乳腺癌的发展进程；此外，过表达miR-556-3p 降低了过表达circPTPRA 对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，进一步提示circPTPRA 通过靶向抑制miR-556-3p来促进乳腺癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述，乳腺癌组织中circPTPRA表达降低，而miR-556-3p 表达升高；过表达circPTPRA 可阻碍乳腺癌细胞MDA-MB-231 细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制与靶向结合并负调控miR-556-3p 表达有关，circPTPRA/miR-556-3p 轴可能为乳腺癌的治疗提供了新的靶点。但是，miR-556-3p 下游靶基因及信号通路对乳腺癌发生发展的影响尚需进一步探究，且需要通过裸鼠移植瘤实验在体内验证circPTPRA/miR-556-3p 轴在乳腺癌发生发展中的作用。