福建省1 例输入性新型冠状病毒全基因组测序分析

林 琦 黄枝妙 福建省疾病预防控制中心，福建省人兽共患病研究重点实验室（福建，福州，350001）

王宇平 郑 晖 翁育伟（通讯作者） 福州国际旅行卫生保健中心（福建，福州，350001）

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是单股正链RNA病毒（Riboviria），属于有包膜的β 属冠状病毒，是目前已知的第7 种可以感染人类的冠状病毒［1］，基因组全长约为30 kb。 SARS-CoV-2 感染患者和无症状感染者均可通过呼吸道飞沫、密切接触等途径将SARS-CoV-2 病毒传播给易感人群［2］。 截至2021 年4 月19 日，全球范围内由SARS-CoV-2 感染导致的肺炎确诊病例共计141 057 106 例， 死亡病例高达3 015 043 例［3］，已造成全球性大流行。

福建省自2020 年2 月26 日本地新冠病例清零后，截至2021 年4 月19 日共确诊境外输入新冠病例290 例。 为了探索并构建SARS-CoV-2 病例标本直接高通量测序的方法（不经过病毒分离培养的病毒全基因组测序方法），本研究选取1 例病毒载量较低的输入性SARS-CoV-2 无症状感染病例咽拭子标本进行病毒全基因组二代测序和生物信息学分析， 为今后快速掌握输入性SARS-CoV-2 病毒的基因组特征、追溯病毒潜在来源、追踪病毒变异变迁规律提供有力的技术支撑， 从分子流行病学角度为我省新冠肺炎疫情的溯源和防控工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

患者女，31 岁，于2021 年1 月8 日从日本回到福建省福州市，福州机场海关对其采集鼻咽拭子进行SARS-CoV-2 核酸检测， 检测结果为SARSCoV-2 核酸阳性。 次日凌晨起被送至定点医院隔离观察，隔离观察期间无明显临床症状，后被确诊为无症状感染者。 福州市海关将该阳性标本（标本号：TH-H210159）于1 月13 日送至福建省疾病预防控制中心进行SARS-CoV-2 全基因组测序。

1.2 核酸提取、复核与定量

取阳性标本液200 μL，采用病毒核酸提取试剂（西安天隆，磁珠法），按试剂盒说明书和自动核酸提取仪的操作说明进行病毒核酸（RNA）提取。 利用新冠病毒核酸检测试剂（达安基因）对所获病毒核酸进行SARS-CoV-2 检测，经复核，该病例核酸中的ORF1ab 基因Ct 值为35.50，N 基因Ct 值为33.38。

1.3 文库构建和全基因组测序

以提取的病毒RNA 作为模板， 按照Ion AmpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel（ThermoFisher Scientific，美国）使用说明进行新型冠状病毒全基因组扩增及测序文库构建。（1）使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit（ThermoFisher Scientific，美国）对病毒RNA 进行反转录，合成第一链cDNA；（2）使用SARS-CoV-2 全基因组扩增引物（ThermoFisher Scientific， 美国） 和Ion AmpliSeq Library Kit Plus（ThermoFisher Scientific，美国）进行病毒全基因组扩增及测序文库构建；（3）采用Ion chef 系统及其配套试剂（ThermoFisher Scientific，美国）来制备高通量测序模板；（4）最后，使用Ion Torrent GeneStudio S5 二代测序系统、Ion 530 芯片及配套试剂（ThermoFisher Scientific，美国）对病毒全基因组进行测序。

1.4 全基因组序列拼接与突变分析

利用Ion Torrent 服务器内置的IRMA（the iterative refinement meta-assembler）插件完成测序数据优化、SARS-CoV-2 全基因组序列拼接及核苷酸突变分析等，利用IGV（version 2.8.13）查看并确认可疑突变位点，剔除非可信变异位点后最终确定病毒全基因序列。

1.5 病毒分型及溯源分析

根据IRMA 插件分析得到的核苷酸和氨基酸突变位点来确定病毒在中国分型法和GISAID 分型法中的对应型别；分别利用在线工具Pangolin（https：//pangolin.cog -uk.io/） 和 Nextclade （https：//clades.nextstrain.org/） 进行Pangolin 分型和Nextstrain 分型［4］。 根据全基因分型结果，从GISAID 上筛选并下载参比序列，采用在线的MAFFT version 7 软件（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/server/） 进行序列比对， 最后使用MEGA 6.0 软件的邻接法（Neighbor-Joing，NJ）构建系统进化树，用bootstrap 抽样1 000次来评估进化树的可靠性。

2 结果

2.1 全基因组测序质量分析

测序下机数据经分析，该病例标本此次测序共获得有效reads 为4 305 361 条，平均读长为187 bp；经Ion Torrent 服务器内置插件IRMA 拼接获得一条全长为29 883 bp 的病毒全基因组序列（GISAID序列号：EPI_ISL_1663017）；Coverage Analysis 插件分析结果显示， 以 SARS -CoV -2 武汉株（EPI_ISL_402125）为参考基因组，本次测序有效reads 中有4 243 271 条reads（有效率为98.56%）能够比对到参考基因组上，测序平均深度为25 762×，基因组覆盖度（完整度）为98.61%，覆盖均一度较好，详见图1。

图1 SARS-CoV-2 全基因组二代测序深度及覆盖度分析

2.2 病毒突变分析

Variant Caller（突变分析插件）分析结果显示，该SARS-CoV-2 病毒基因组序列同武汉参考株（EPI_ISL_402125）序列相比，共存在18 处核苷酸突变，突变类型包含17 个SNP（单核苷酸多态性）和1处MNP（多核苷酸多态性），分别来自1 个非编码区（ORF1ab 上游基因） 和5 个基因编码区 （包括：ORF1ab、S、ORF3a、ORF8、N）， 编码区中11 个突变位点来自ORF1ab 基因、1 个来自S 基因（D614G）[x]、1 个来自ORF3a、1 个来自ORF8 基因、3 个来自N 基因；氨基酸突变类型包括7 个同义突变和10 个非同义突变。 该SARS-CoV-2 病毒全基因组序列突变情况见表1。在所有突变中，未见潜在的可导致毒株传播力或致病性增强的氨基酸变异位点。

2.3 病毒型别分析

应用中国分型法、Pangolin 分型法、Nextstrain分型法及GISAID 分型法等4 种不同的新冠病毒全基因分型方法对该病毒进行分型， 分型结果显示：该输入性新冠病毒在中国分型法中属于L 基因型欧洲家系分支，处于Pangolin 谱系中的B.1.1.214 进化分支上，Nextstrain 分型为20B，GISAID 分型为GR 型。 不同分型结果及依据见表2。

2.4 基于全基因组的病毒溯源分析

根据该SARS-CoV-2 病毒全基因组的分型结果， 从GISAID 上筛选并下载了43 条参比序列，包含了Pangolin 进化分支A 和B 及其子分支（B.1、B.1.1.214、B.1.1.7 英国变异株分支、B.1.351 南非变异株分支、P.1 巴西变异株分支等）。

将该SARS-CoV-2 病毒全基因组与所有参比序列构建系统进化树（图2），结果显示该SARS-CoV-2病毒基因组序列与来自日本的参考株聚成一簇，共同处于进化分支B.1.1.214 上，且与其中一株来自日本大阪（Japan/Osaka）的SARS-CoV-2 序列最接近；该病毒基因序列与我国本土流行的SARS-CoV-2 毒株（武汉1-3 月份流行株）属于不同的基因型，提示该病毒为输入性，而非本土新冠病毒的持续传播；此外，该病毒序列与英国变异株（B.1.1.7 分支）、南非变异株（B.1.351分支）及巴西变异株（P.1 分支）处于不同分支上，无明显相关性。 进化分析结果证实该SARS-CoV-2 病毒来源于日本，且很可能来源于日本大阪地区。

图2 SARS-CoV-2 病毒全基因组进化树

3 讨论

本研究采用SARS-CoV-2 全基因组靶向扩增结合Ion S5 高通量二代测序技术，成功地从1 例病毒载量较低（ORF1ab 基因Ct 值为35.50，N 基因Ct值为33.38） 的境外输入新冠病例标本中获得一条全长为29 883 bp 的病毒全基因组序列， 平均测序深度为25 762×，基因组覆盖度达到98.61%，高质量的测序结果为后续病毒全基因组突变位点分析、病毒分型及进化分析等溯源工作提供了可靠的数据支撑。

既往研究表明，病毒的变异可能导致病毒的传播力、致病力发生改变［5-7］，因此快速测定病毒基因组并识别关键突变，是开展病例管理和疫情处置的关键。 靶向扩增结合高通量测序的技术方法，能够跳过病毒分离培养环节，直接从病毒载量较低的临床标本中靶向扩增SARS-CoV-2 全基因组序列，再利用二代测序的高通量优势，在一次测序中获得大量数据，这些数据为拼接出完整的SARS-CoV-2 全基因组序列提供了可能性，也为后续的基因突变分析提供了足够的测序深度， 因此该技术方法在SARS-CoV-2 的快速诊断、 变异分析和分子流行病学研究等工作中发挥了巨大作用。

本研究测序得到的SARS-CoV-2 病毒的中国分型为L 基因型欧洲家系， Pangolin 分型为B.1.1.214，Nextstrain 分型为20B，GISAID 分型为GR型。 进化分析显示，该SARS-CoV-2 病毒与来自日本的参考株共同处于进化分支B.1.1.214 上，与其中一株来自日本大阪（Japan/Osaka）的病毒序列最接近， 并不与我国本土流行的毒株处于同一分支上，结果证实了该病毒确实为日本输入，且很可能来自日本大阪。 此外，该SARS-CoV-2 序列的N 蛋白含有GGG28881-28883AAC 突变， 有研究统计发现28881-28883 这3 个位点的碱基突变发生率大于5%，可能导致核酸检测试剂盒对N 蛋白基因的检测灵敏度降低［8-9］。由于中国疾病预防控制中心早期公开的检测引物及靶标序列位置中N 基因的上游引物序列包含了28881-28883 这3 个核苷酸位点［10］，所以需要对N 基因引物靶向区的核苷酸突变情况做持续监测，以及时评估试剂的灵敏度和准确性。