银耳多糖对冻干植物乳杆菌细胞膜 及糖代谢酶的保护作用

李兵兵，龙慧，伍恩慧，李祎，夏宁，滕建文，黄丽，韦保耀

（广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 530004）

联合国粮农组织和世界卫生组织联合专家委员会于2001年提出益生菌科学定义：益生菌是指活的微生物，当摄取足够数量时，对宿主健康有益[1]。而益生菌在体内产生有益作用的活菌数量应不少于106cfu/g[2,3]，因此保持益生菌在加工过程中的活性显得十分重要。冷冻干燥是保持益生菌活性最常用和最成功的技术之一[4,5]。但冷冻干燥会使益生菌遭受低温、冷冻、渗透、低压和干燥胁迫，造成细胞膜功能损伤以及细胞内酶活性降低，从而导致益生菌的活力丧失[6-8]。影响冷冻干燥后益生菌活力的因素有很多，包括菌的特性、生长介质、冷冻干燥前预处理、冷冻干燥工艺以及冷冻干燥保护剂[9,10]。其中冷冻干燥保护剂具有提高益生菌的抗冻性及延长益生菌粉储藏时间的双重作用，是目前研究的热点[11,12]。而蛋白质和碳水化合物由于来源天然、无毒和良好的生物相容性被广泛用作益生菌冷冻干燥保护剂[13]。其中碳水化合物类保护剂能提高冻干体系的玻璃化转变温度，从而减少益生菌细胞膜和酶因冰晶的生成而受到的损伤[14,15]。一些具有益生作用的碳水化合物类保护剂如果寡糖[16]、低聚半乳糖[17]等在减少冰晶破坏的同时还具有促进益生菌在肠道增殖的功能。然而由于碳水化合物类保护剂的乳化性较差，以及冻干后疏松多孔抗机械压力差，不足以有效保护益生菌，通常会将其与蛋白类保护剂复合以提高冻干保护效果[18,19]。

银耳多糖（Tremellapolysaccharides，TPS）是一类具有益生活性的真菌多糖。有研究表明银耳多糖能够促进家禽肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖，改善家禽的肠道有益菌群[20]；目前，银耳多糖已被用于合生元产品中[21]；此外，由于其物理特性上的高黏与乳化性，已有研究将其用于改善酸奶的口感[22]及提高饮料稳定性[23]等食品工业中；而且银耳多糖还能减少冰淇淋中冰晶的生成[24,25]。银耳多糖的界面性质和益生作用使其具备作为益生菌功能性冷冻干燥保护剂的潜力，而益生元作为保护剂以提高益生菌在生产和储藏过程中的活力在研究中受到了广泛的关注[26]。然而目前还没有研究报道银耳多糖在益生菌冷冻干燥保护剂领域的应用。

因此，基于银耳多糖界面性质差的缺点，本试验以银耳多糖复合酪蛋白酸钠作为冷冻干燥保护剂，以植物乳杆菌为试验菌株，探讨银耳多糖作为一种具有益生活性的益生菌冷冻干燥保护剂的可行性，为银耳多糖的开发利用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌Lp-115（Lactobacillus plantarumLp-115），丹尼斯克有限公司；银耳子实体多糖，上海辉文生物技术股份有限公司；酪蛋白酸钠（Sodium caseinate，NaCS），山东德佳生物有限公司；己糖激酶、丙酮酸激酶及ATP酶检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；MRS培养基所用试剂及其它试剂皆为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

真空冷冻干燥机，德国Christ公司；恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；手提式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型净化工作台，苏州安泰空气技术有限公司；磁力搅拌器，金坛市医疗仪器厂；涡旋仪，意大利VELP科学仪器有限公司；TLE204E，分析天平、pH计，上海梅特勒－托利多仪器有限公司；Nicolet iS10傅立叶变换红外光谱仪，美国热电公司；SU-1510型扫描式电子显微镜（SEM），日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种培养

购买的植物乳杆菌按3.0%的接种量置于MRS液体培养基中培养24 h，活化至第三代，然后在MRS琼脂培养基上划线，37 ℃培养48 h；之后再挑单菌落于10 mL MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，最后再按3.0%的接种量转接到30 mL MRS液体培养基中进行扩大培养11 h后，离心（4 ℃，4000 r/min，10 min，）收集菌泥，将收集到的菌泥用无菌生理盐水洗涤两次后，重悬于30 mL无菌蒸馏水中得到菌液备用；同时用平板计数法对该菌液计数。

1.3.2 植物乳杆菌冻干粉的制备

冷冻干燥保护剂的配制：分别配制浓度为4.0%（m/m）的银耳多糖和酪蛋白酸钠溶液，并将两者分别按1:1、1:2、1:3、2:1、3:1的质量比（m/m）混合均匀，80 ℃灭菌30 min，冷却后作为复合保护剂备用。

冻干菌粉制备：取上述配制的保护剂与菌液混合均匀，并添加无菌蒸馏水调整保护剂的终浓度为2.0%，保护剂与菌液的比例为5:1（m/V），空白对照组加相同比例的无菌蒸馏水。将制备的混合液于-80 ℃预冻2 h后，进行冷冻干燥。冷阱温度-80 ℃，真空度0.3 Pa，温度25 ℃，干燥时长48 h。

1.3.3 植物乳杆菌存活率（Viability）的测定

取0.1 g冻干菌粉于9.9 mL无菌生理盐水中完全溶解，梯度稀释后利用平板计数法计数。根据式（1）计算存活率。式中NA是冻干后活菌数，NB为冻干前活菌数，单位为cfu/g。

1.3.4 傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared，FT-IR）分析

参考Xue等[27]的方法并稍做修改，称取1 mg制备的菌粉与100 mg溴化钾研磨混合压片，然后进行傅里叶红外光谱测定。测定范围为400～4000 cm-1的吸收光谱，分辨率为4 cm-1，环境温度为25 ℃，扫描信号累加16次，OPD速度0.2 cm/s。

1.3.5 扫描电镜

参考Li等[7]的方法并稍做修改，取少量制备的菌粉于贴有导电胶的铝片表面，将菌粉涂抹均匀，多余的菌粉用氮气小心吹去，然后将铝片镀金5 min。用扫描电子显微镜在5 kV的电压下，图像放大10000倍，获取样品的微观图像。

1.3.6 糖代谢关键酶活性测定

1.3.6.1 乳酸脱氢酶的活性测定[28]

超声提取乳酸脱氢酶：取制备的菌粉0.1 g溶解于9.9 mL无菌生理盐水后，离心收集菌体，之后将菌体重新悬浮于同体积且含有2 mmol/L EDTA的磷酸钾溶液（pH 7.0，0.2 mol/L）中；取5 mL菌悬液在超声细胞破碎仪中冰浴超声100次，功率为20%，每次超声3 s，间隔10 s；最后离心（10000 r/min，4 ℃）收集上清液，置冰上待测。

酶活测定：测定体系共3 mL，含有0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.3）2.7 mL，6.6 mmol/L NADH和30 mmol/L丙酮酸钠各0.1 mL，以及0.1 mL酶提取液，在25 ℃进行催化反应，每0.5 min读取一次吸光值，连续5 min，以吸收值对时间作图，取初始的线性范围，计算每分钟降低的吸收值，以每分钟降低1.0个吸收值为1个酶活单位，以U表示。

1.3.6.2 己糖激酶、丙酮酸激酶及ATP酶活性测定

己糖激酶（Hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）及ATP酶活性测定按照酶活试剂盒（购自索莱宝）上的方法对三种关键酶进行活性测定。具体流程如下所述：

酶提取液配制：按照操作说明将酶活试剂盒中的各种试剂混合配制酶提取液；

超声提取酶：先收集细菌到离心管内，离心后弃上清；按照细菌数量（104个）：提取液体积（mL）为500:1的比例加入酶提取液，超声波破碎细菌（冰浴，功率20%，超声3 s，间隔10 s，重复100次）；离心（8000 r/min，4 ℃，10 min），取上清，置冰上待测；

酶活测定：按照酶活试剂盒说明测定各酶活力。

1.3.7 细胞膜性质分析

1.3.7.1 胞内Ca2+含量测定[29]

采用Fluo3-AM荧光探针法测定制备的菌粉胞内Ca2+含量：取5 mmol/L的Fluo3-AM/DMSO荧光染液1 μL置于5 mL菌液中（1.0×109cfu/mL），避光条件下，37 ℃孵育30 min，离心（10000 r/min，5 min）弃上清，用生理盐水洗涤后，重悬于5 mL生理盐水中。将染色后的菌液置于荧光分光光度计内测荧光强度，λex为488 nm，λem为528 nm。

1.3.7.2 细胞膜流动性

参照Li等[30]的方法测定细胞膜的流动性，具体流程如下所述：

荧光染色剂的配制：将1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene，DPH）溶于四氢呋喃配制2 mmol/L的DPH染色储备液，每次实验前用0.01 mol/L的PBS溶液稀释成2 μmol/L。

菌粉前处理：制备的菌粉用无菌水复溶后离心（4 ℃，8000 r/min，10 min）收集菌体，洗涤后重悬于无菌水中并调整其浓度为1×107cfu/mL；取2 mL菌液用2 mL体积分数为0.37%的甲醛溶液固定30 min，离心（4 ℃，8000 r/min，10 min）收集菌体并用0.01 mol/L的PBS溶液洗涤两次，加入2 mL PBS（0.01 mol/L）溶液重悬细菌，再加入0.2 mL DPH染色液染色45 min，离心（4 ℃，8000 r/min，10 min）收集菌体并用0.01 mol/L的PBS溶液洗涤两次，重悬于5 mL PBS（0.01 mol/L）溶液后置于荧光分光光度计检测荧光强度，λex为361 nm，λem为443 nm。

1.3.7.3 细胞膜完整性

细胞膜完整性的测定参考Li等[7]的方法并稍作修改。将冻干的菌粉溶解于无菌生理盐水中，菌浓度调整为1.0×107cfu/mL；取1 mL菌液与5 mL碘化丙啶溶液（pH 7.2，60 mmol/L）混匀，在25 ℃暗处孵育15 min；离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液（pH 7.2，60 mmol/L）洗涤两次，去除未结合的染料，重悬于10 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.2，60 mmol/L）中备用。在流式细胞仪上测定碘化丙啶荧光，每个样本分析10000个细胞，根据膜完整细胞数与细胞总数的比值表征膜完整性百分比。

1.3.8 数据统计分析

数据表示为平均值±标准差。采用Origin 7.5作图，SPSS 10.0进行单因素方差分析，p＜0.05为显著水平。

2 结果与分析

2.1 保护剂对冻干植物乳杆菌存活率的影响

以菌存活率为指标，评价不同比例的银耳多糖与酪蛋白酸钠复合保护剂的保护效果，结果如图1所示。在未添加保护剂时，植物乳杆菌在冷冻干燥过程中的存活率只有0.52%，几乎全部失活；添加银耳多糖、酪蛋白酸钠及两者复合物处理，植物乳杆菌的存活率均可达到40.00%以上，其中不同比例的保护剂对植物乳杆菌的保护效果是有所差异的。单一的银耳多糖与酪蛋白酸钠的保护效果差异不显著，植物乳杆菌的存活率分别为42.19%和47.98%；复合保护剂中银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例为1:3、1:2、1:1时，复合保护剂的保护效果与单一的银耳多糖保护剂没有显著性差异，植物乳杆菌的存活率分别为43.66%、47.41%和47.43%；复合保护剂中银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例为2:1时，复合保护剂的保护效果与单一的银耳多糖保护剂具有显著性差异，植物乳杆菌的存活率为48.85%；当银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例达到3:1时，植物乳杆菌的存活率达到最大值55.39%。银耳多糖与酪蛋白酸钠都能显著提高植物乳杆菌在冷冻干燥过程中的存活率，但当两者复合时，少量的酪蛋白酸钠会显著提升银耳多糖对植物乳杆菌的冻干保护效果，过量的酪蛋白酸钠对银耳多糖的保护效果提升不显著。这可能是由于两者复合后银耳多糖能更有效的抑制胞外冰晶的生成从而减少菌细胞受到损伤[31]。Li等[7]发现滑菇多糖在冻干过程中对干酪乳杆菌也有一定的保护作用，当滑菇多糖浓度为0.04、0.02、0.01、0.005、0.002和0.001 mg/mL时，干酪乳杆菌冻干后的存活率分别为74.5%、74.4%、66.3%、62.2%、56.8%和42.5%，当其与辅助冷冻保护及混合时，干酪乳杆菌的存活率分别提高至80.4%、80.5%、75.5%、73.1%、66.2%和50.5%，显示出明显的协同作用且保护效果强于银耳多糖。Guedesa等[32]的研究表明浓度为10%（m/V）的β-葡聚糖作为冻干保护剂时，Lactobacillus plantarumLP-49和Lactobacillus plantarumLP-201冻干后的存活率为18.20%与12.59%，保护效果弱于银耳多糖。

图1 植物乳杆菌冻干后的存活率Fig.1 Survival rate ofLactobacillus plantarum after freeze-drying

2.2 冻干菌粉的红外光谱图

图2 植物乳杆菌冻干粉的FT-IR图Fig.2 FT-IR spectrum of bacterial powder

银耳多糖复合酪蛋白酸钠能够提高菌粉存活率，为了进一步研究两者是否发生相互作用从而对植物乳杆菌的活力保持产生影响，对制备的菌粉进行红外光谱分析。从图2可知，TPS的吸收峰出现在3417 cm-1、2925 cm-1、1650 cm-1、1419 cm-1和1076 cm-1附近，分别代表O-H伸缩振动峰，C-H伸缩振动变角振动峰，糖醛酸中的羰基C=O振动，羰基上C-O的伸缩振动峰以及C-O-C变角振动峰[33,34]。NaCS的吸收峰出现在3423 cm-1、2929 cm-1和1076 cm-1附近，分别代表O-H伸缩振动峰，C-H键的伸缩振动以及N-H面内弯曲振动；酪蛋白酸钠有两组特征吸收谱带：酰胺I带和酰胺II带，其波长分别对应1700～1600 cm-1和1550～1400 cm-1[35]，且随着银耳多糖的加入，酰胺I带和II带的伸缩振动峰发生偏移，这说明酪蛋白酸钠与银耳多糖发生了相互作用；在1419 cm-1附近，银耳多糖羰基上C-O的伸缩振动峰向高波长方向移动，这表明银耳多糖与酪蛋白酸钠分子之间可能存在氢键作用；此外，在1076 cm-1附近，银耳多糖糖环中的C-O-C变角振动峰强度随着酪蛋白酸钠的增加发生偏移，也表明TPS与NaCS分子间存在相互作用[36]。Sohrab Sharifiab等[37]也利用傅里叶红外光谱技术发现乳清分离蛋白与阿拉伯胶之间形成缩合物提高了植物乳杆菌在奶酪中的活性。

2.3 冻干菌粉的形态观察

图3 植物乳杆菌冻干粉的扫描电子显微镜图Fig.3 Scanning electron microscope of bacterial powder

通过扫描电子显微镜观察冷冻干燥制得的菌粉，结果如图3所示。添加保护剂后冷冻干燥制得的菌粉为形状和尺寸不规则的薄片状，植物乳杆菌附着在保护剂表面，且菌体随机分布。由于冷冻干燥过程涉及到冷冻、初级干燥（升华）、次级干燥（解吸），溶液中水分在真空环境中直接从冰升华成水蒸气，因此菌粉表面会因失水而出现微孔。通过对比不同比例保护剂菌粉的扫描电镜图，发现其微观结构具有明显差异。酪蛋白酸钠冻干后结构致密，但表面孔隙较多；银耳多糖冻干后结构疏松，但表面孔隙少。两者复合后，随着复合保护剂中银耳多糖的增加，菌粉表面的微孔越来越少，出现这一现象可能是由于银耳多糖一方面能够提高保护剂的玻璃化转变温度，从而减少冰晶的生成[38]，另一方面会增强保护剂的黏性，进而使菌粉表面结构更加稳固，减少了冻干过程中的坍缩现象；同时可以看出，酪蛋白酸钠的添加使得菌粉表面更加致密。菌粉微观结构表明，银耳多糖能够抑制冻干过程中冰晶的生成，降低菌粉表面的孔隙率；同时复合保护剂结合了单一保护剂各自的优势，改善了菌粉的表面性质，可能会有利于菌粉的储藏稳定性。Diako等[39]的研究也发现明胶包埋的益生菌粉表明光滑、均匀、结构更为致密，而果胶包埋的益生菌粉则呈现出粗糙、网状、有裂隙的结构，两者结构上的差异导致了在储藏过程中对益生菌保护效果的不同；而银耳多糖包埋的菌粉表面没有明显的裂隙，表现出比果胶更好的包埋效果。

2.4 冷冻干燥保护剂对植物乳杆菌细胞膜性质的影响

2.4.1 冷冻干燥保护剂对细胞膜通透性的影响

图4 不同保护剂对植物乳杆菌胞内钙离子含量的影响Fig.4 Effect of different protectants on intracellular calcium content ofLactobacillus plantarum

通过测定菌体细胞膜的性质变化来进一步说明保护剂的保护效果。由于冷冻过程中形成的冰晶会损伤细胞膜，造成细胞膜通透性增加，导致胞外钙离子内流。因此可以通过测定胞内钙离子含量变化来反映细胞膜的通透性。从图4可知，未添加保护剂时，Ca2+荧光强度最高，为43.10；添加NaCS后Ca2+荧光强度降低到35.89，且随着保护剂中银耳多糖含量的增加，Ca2+荧光强度越来越低；当银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例为1:3、1:2、1:1、2:1、3:1时，Ca2+荧光强度分别为37.39、34.98、33.50、32.56、29.98。当保护剂为银耳多糖时，荧光强度达到最低，为25.83。说明银耳多糖对维持细胞膜具有较强的保护作用。这可能是因为多糖类保护剂中的羟基与磷脂双分子层形成氢键，保持了细胞膜结构的稳定性，从而减少了胞外Ca2+的内流[40]。王飚等[41]的研究发现冻干后的德氏乳杆菌胞内钙离子荧光强度远高于正常细胞，约为正常菌体胞内钙离子荧光强度的5倍，添加有海藻糖保护剂的冻干菌体胞内钙离子荧光强度相对未添加保护剂的菌体降低约40%，保护效果优于银耳多糖。

2.4.2 不同冷冻干燥保护剂对细胞膜流动性的影响

图5 不同保护剂对植物乳杆菌细胞膜流动性的影响Fig.5 Effects of different protectants on membrane fluidity of Lactobacillus plantarum

细胞膜的流动性可以反映细胞膜的结构是否完整。当荧光探针DPH与细胞质膜中磷脂的脂烃链区结合时，体系的介质黏度增加，顺反异构化受到抑制而成为唯一能发光的全反构型，此时DPH荧光强度低表明结构有序性低或细胞膜流动性高[30,42]。由图5可知，未添加保护剂组的荧光强度最高，为9.82；添加保护剂后荧光强度显著降低（p＜0.05），说明添加保护剂有利于维持细胞膜正常的流动性；保护剂为NaCS的菌粉与保护剂为银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例为1:3、1:2、1:1和2:1的菌粉的荧光强度无显著性差异，其荧光强度分别为6.02、6.83、6.58、6.81、6.01；保护剂为银耳多糖时，荧光强度为4.91。同时可以看出，少量的银耳多糖对复合保护剂的保护效果影响不明显，只有当银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例达到3:1时，保护效果才得到显著增强（p＜0.05）且达到最大，此时荧光强度为3.73。Li等[15]以蔗糖15%（m/V），海藻糖5%（m/V），海藻糖10%（m/V）和重组脱脂牛奶10%（m/V）作为保护剂对Lactobacillus reuteriCICC6226细胞膜的保护作用，发现只有海藻糖10%（m/V）和重组脱脂牛奶10%（m/V）能够改善细胞膜的流动性。

2.4.3 不同冷冻干燥保护剂对细胞膜完整性的影响

图6 不同保护剂对植物乳杆菌细胞膜完整性的影响Fig.6 Effects of different protectants on the membrane integrity ofLactobacillus plantarum

为进一步说明保护剂对细胞膜性质的影响，本研究利用PI只能进入细胞膜受损的植物乳杆菌体内与其核酸反应发出红色荧光的原理，通过流式细胞仪测定其染色情况以表征细胞膜的完整性。如图6所示，图中峰出现在左侧代表未发出红色荧光的菌体占总菌数的比例，右侧代表发出红色荧光的菌体占总菌数的比例。

未经冷冻干燥的植物乳杆菌（a）中98.55%的菌未检测出红色荧光，说明大多数菌的细胞膜完整；在无保护剂（b）的情况下，98.35%的植物乳杆菌经冷冻干燥后细胞膜完整性遭到破坏；而在添加保护剂后，细胞膜受损的植物乳杆菌比例显著降低，但各保护剂对细胞膜的保护作用有所差异。保护剂为NaCS时，细胞膜受损的植物乳杆菌百分比为59.10%；保护剂为银耳多糖比酪蛋白酸钠等于1:3、1:2、1:1、2:1和3:1时，膜受损的植物乳杆菌百分比分别为48.15%、57.40%、39.50%、47.40%、43.40%；保护剂为银耳多糖时，细胞膜受损的植物乳杆菌百分比最低，为37.90%。相比于单一的酪蛋白酸钠保护剂，将其与银耳多糖复合后，它的保护效果得到了提升，可能是因为银耳多糖的加入提高了复合保护剂的玻璃化转变温度，从而减少冰晶的形成，进而减少细胞膜受到的机械损伤[43]。Jéssica等[32]研究发现β-葡聚糖包埋的Lactobacillus plantarumLP-49和Lactobacillus plantarumLP-201在冷冻干燥过程中膜受损的菌占比分别为31.90%和8.90%，而低聚果糖包埋的Lactobacillus plantarumLP-49和Lactobacillus plantarumLP-201在冷冻干燥过程中膜受损的菌占比分别为16.20%和18.80%，多糖对细胞膜的保护作用受益生菌的固有特性影响。

2.5 不同保护剂对冻干菌粉的糖代谢酶活性的影响

2.5.1 乳酸脱氢酶活性变化

图7 不同保护剂对乳酸脱氢酶活性的影响Fig.7 Effect of different protectants on LDH activity

冻干后菌粉的活性变化还表现在对细胞内糖代谢酶的影响上[44]。有研究表明，冷冻干燥会对乳酸脱氢酶造成损伤，从而导致植物乳杆菌细胞的活力下降[45]。从图7可知，未冻干的菌乳酸脱氢酶活力为0.37 U/mL，冻干后菌的乳酸脱氢酶活力会明显降低；未添加保护剂时酶活为0.11 U/mL，同时可以看出，在冻干过程中添加保护剂能显著降低乳酸脱氢酶受到的损伤，当保护剂为NaCS以及银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例为1:3、1:2、1:1、2:1时，乳酸脱氢酶活力分别为0.25、0.24、0.27、0.26、0.24 U/mL，酶活无显著性差异；当银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例为3:1时，保护剂对乳酸脱氢酶的保护效果达到最高水平，此时酶活为0.32 U/mL；但单一的银耳多糖保护剂对乳酸脱氢酶的保护效果最低，酶活为0.21 U/mL。结果表明，冷冻干燥会对植物乳杆菌的乳酸脱氢酶造成损伤，而保护剂能降低此种损伤，其中复合保护剂比单一的银耳多糖保护剂的效果更好，并且银耳多糖只有在高添加量时才会显著提高复合保护剂对乳酸脱氢酶的保护效果。Li等[15]研究也发现不同保护剂对乳酸脱氢酶活力有显著性影响，蔗糖15%（m/V）、海藻糖10%（m/V）以及重组脱脂牛奶10%（m/V）作为保护剂时，乳酸脱氢酶的活力分别为9.11 U/mg、8.38 U/mg和8.96 U/mg，与未冻干的菌的酶活无显著性差异，而海藻糖5%（m/V）则无法有效保护乳酸脱氢酶。

2.5.2 己糖激酶和丙酮酸激酶活性变化

图8 不同保护剂对己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）活性的影响Fig.8 Effects of different protectants on the activities of hexokinase (HK) and pyruvate kinase (PK)

己糖激酶和丙酮酸激酶都是糖酵解途径中的关键酶，其活性大小与乳酸菌的糖代谢速率有关，本研究通过测定冷冻干燥对其活性大小的影响，结果如图8所示。从图中可以看出，未冻干的植物乳杆菌己糖激酶和丙酮酸激酶的活力分别为44.52 U/g和0.77 U/g；无保护剂的植物乳杆菌己糖激酶和丙酮酸激酶分别为33.73 U/g和0.46 U/g；保护剂为NaCS和TPS的植物乳杆菌己糖激酶活力分别为25.69 U/g与39.39 U/g，丙酮酸激酶的活力分别为0.48 U/g与0.67 U/g；保护剂中银耳多糖比酪蛋白酸钠等于1:3、1:2、1:1、2:1及3:1时，植物乳杆菌粉的己糖激酶活力分别为29.42、35.98、31.59、30.38、31.18 U/g，丙酮酸激酶的活力分别为0.56、0.57、0.43、0.48、0.71 U/g。尽管不同比例保护剂菌粉的己糖激酶和丙酮酸激酶活性大小不同，但与未添加保护剂的冻干菌粉及未冻干的菌相比，没有显著性差异，这一结果表明冷冻干燥过程中，己糖激酶和丙酮酸激酶的活性并不会受到太大影响，具体原因尚不明确，推测可能与己糖激酶和丙酮酸激酶的亚细胞定位以及分子量大小有关。Li等[15]在研究蔗糖、海藻糖、酪蛋白酸钠、脱脂乳等不同保护剂对冷冻干燥后乳酸杆菌的己糖激酶和丙酮酸激酶活力的影响时，也发现冷冻干燥对己糖激酶和丙酮酸激酶的影响不大。

2.5.3 ATP酶活性变化

图9 不同保护剂对ATP酶活性的影响Fig.9 Effect of different protectants on ATPase activity

通过测定冷冻干燥后菌粉ATP酶的活性来反映菌粉活力大小，结果如图9所示。从图9可知，未冻干的菌Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分别为147.62 U/g和68.75 U/g；未添加保护剂的菌冻干后Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分别为41.45 U/g和12.73 U/g；保护剂为NaCS时，菌冻干后Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分别为82.50 U/g和28.61 U/g；保护剂为TPS时，菌冻干后Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分别为117.97 U/g和34.95 U/g；冻干前后两种ATP酶的活性都具有显著性变化，而保护剂的添加能降低冷冻干燥对ATP酶活性的损伤。少量添加银耳多糖并不能显著提高保护剂对Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的保护效果，只有当银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例达到3:1时，保护效果才得到显著提高，此时Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分别为121.61 U/g和45.64 U/g；同时也可以看到单一的银耳多糖对Na+-K+-ATP酶的保护作用也很强，说明银耳多糖在对Na+-K+-ATP酶的保护方面做出了更大的贡献。银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例为1:3和1:2时，菌冻干后Na+-K+-ATP酶的活力分别为62.62 U/g和69.33 U/g，Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力分别为23.17 U/g和17.20 U/g；与未添加保护剂组相比，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性大小并没有显著性差异，当银耳多糖与酪蛋白酸钠的比例达到3:1时，保护效果达到最大，说明银耳多糖含量低对Ca2+-Mg2+-ATP酶的保护效果没有促进作用；同时可以看出单一的酪蛋白酸钠和银耳多糖保护剂也具有明显的保护作用。Castro等[45]的研究也表明冷冻干燥过程中ATP酶活性的降低是造成菌粉活力降低的原因之一。Li等[15]研究发现10%（m/V）的海藻糖对Lactobacillus reuteriCICC6226的ATP酶具有显著的保护效果，菌冻干后的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶的活力分别为23.44、23.44、24.00 U/mg，与未冻干菌的酶活力大小相比基本不变，表现出比银耳多糖更佳的保护效果。

3 结论

本文研究了银耳多糖与酪蛋白酸钠在冻干菌粉的制备过程中对植物乳杆菌细胞膜和糖代谢酶的保护作用。结果表明，银耳多糖与酪蛋白酸钠之间产生了非共价相互作用，菌粉表面的孔隙率随银耳多糖含量的增加而降低，当银耳多糖与酪蛋白酸钠的质量比为3:1时：植物乳杆菌的存活率最高（55.39%）；DPH的荧光强度最低（4.91）；菌的乳酸脱氢酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活力最高，分别为0.32 U/mL、121.61 U/g及45.64 U/g，但冷冻干燥前后己糖激酶和丙酮酸激酶活力无显著性变化。此外，菌体细胞内Ca2+荧光强度随保护剂中银耳多糖含量的增加从43.10降低到25.83；保护剂为银耳多糖时膜受损的菌百分比从98.35%最大降低至37.90%。因此，银耳多糖对冻干植物乳杆菌的细胞膜和糖代谢酶具有较强的保护作用。与一些常见的碳水化合物类保护剂如蔗糖、海藻糖和乳糖等二糖相比，银耳多糖对益生菌的保护效果并没有优势，但其它二糖并不具备银耳多糖的益生作用；后续研究可从优化冻干工艺、优化保护剂配比和种类以及对银耳多糖改性等方面提高银耳多糖对益生菌的冻干保护效果。