牙龈卟啉单胞菌与ESCC研究进展

刘书培，张秀森，李婉莹，赵 迪，杨 泽，张旭东，原 翔

人体内大约有30万亿个细菌[1]。自从人类微生物组项目完成以来[2]，对微生物在人类健康中所起的作用越来越感兴趣，许多研究已经将微生物群落的变化与全身状况联系起来，如动脉粥样硬化、炎症性肠病、过敏和糖尿病[3-5]。在受微生物群影响的全身疾病中，癌症也不例外。很多肿瘤患者体内微生物群的变异和肿瘤组织内的异常微生物已被确定为肿瘤发生的关键标志物。口腔微生物组可以影响食管微生物组，从而可能促进ESCC的发生[6-7]。这一概念为微生物群和ESCC发展之间的关系增加了另一层复杂性。ESCC是胃肠道侵袭性最强的肿瘤之一，发病率也在逐年上升[8]。既往研究报道唾液中P.gingivalis的数量与口腔癌和ESCC的进展有关。在ESCC组织中P.gingivalis增多，并且这种感染与ESCC患者较短的生存时间密切相关。此外，较高的血清抗P.gingivalis抗体水平对ESCC的诊断和预后也具有重要意义。所有这些均支持P.gingivalis是ESCC的关键因素之一，并可能对ESCC的发生、进展和治疗反应产生影响[9]。

ESCC是发展中国家食管癌的主要组织学亚型，在中国是癌症相关死亡的第四大原因[8]。ESCC死亡率高，主要因为大多数病例在最初诊断时已经到了疾病终末期，尽管有多种治疗手段，ESCC患者的5 a总生存率也仅为10%[8]。因此，寻求预防、早期发现和靶向治疗的新方法至关重要。本文就近年来P.gingivalis与ESCC相关性及其发病机制进行综述。

1 毒力因子

P.gingivalis是一种革兰氏阴性专性厌氧杆菌，可表达多种毒力因子，包括菌毛、牙龈蛋白酶、血凝素、外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等[10]，主要的致病机制为造成免疫防御失调[11]。P.gingivalis是一种胞内致病菌，可侵袭多种真核细胞，改变其表达，规避宿主的免疫防御，造成再次感染。此外，它还能与宿主相互作用并在组织中定植。P.gingivalis可调节宿主的免疫反应，促进微生物生物膜的增殖，从而破坏宿主的稳态[11]。

为了有效定植，P.gingivalis分泌蛋白黏附素、血凝素和蛋白酶。P.gingivalis OMVs在CTD (C-terminal domain-family)蛋白中表现出丰富的选择性，支持细菌内聚，促进生物膜的发育，并作为转运细菌的中间体[12]。精氨酸特异性蛋白酶(Arg-specific gingipain,Rgp)和赖氨酸特异性蛋白酶(Lys-specific gingipain,Kgp)是半胱氨酸蛋白酶，属于细胞外蛋白酶，对先天性和适应性免疫应答均有多种作用。这些半胱氨酸蛋白酶能够广泛降解结缔组织和宿主防御分子。Rgp和Kgp被证明通过激活激肽级联和补体C3和C5蛋白的液相转化，与炎症缓解和宿主防御高度相关。除了这些防御，一些其他因素，如菌毛、血凝素、脂多糖、鞭毛和主要外膜蛋白，也被证明具有潜在的毒性[13]。

2 肽基精氨酸脱亚胺酶和蛋白质瓜氨酸化在癌症发病中的潜在作用

P.gingivalis是目前已知的唯一产生肽基精氨酸脱亚胺酶(peptidyl-arginine deimi-nase，PAD)的病原体。这种酶通过脱去蛋白质和肽中的精氨酸残基来修饰细菌和宿主蛋白质，将它们转化为瓜氨酸[14-16]。蛋白质瓜氨酸化通过改变蛋白质原有三维结构和功能的空间排列来解除对宿主炎症信号网络的调控[17]。宿主的内源性瓜氨酸来自5种钙依赖酶，称为肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD 1，2，3，4/5和6)，这些酶与PAD非常相似，但又不完全相同[18-20]。宿主PADs与多种人类和动物癌症有关。使用泛PAD抑制剂氯脒(Clam)抑制细胞骨架肌动蛋白的脱氨基作用，可以抑制肿瘤进展和炎症症状[21]。

3 P.gingivalis通过激活NF-kB信号通路来促进ESCC

细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和C-Myc是G1-S转变的关键调节器[22]。Western印迹和RT-PCR分析表明，在P.gingivalis刺激后，Cyclin D1和C-Myc的表达上调。在P.gingivalis刺激后，核中NF-kB(P65)的表达也上调[23]。Cyclin D1和C-MYC是NF-kB途径的下游靶标[24]。另外，MMP2和BCL-XL的表达在蛋白质和mRNA水平上也上调。荧光素酶测定结果表明，ECA109和KYSE510细胞P.gingivalis刺激中，NF-kB的活性增加。相反，对照组中NF-kB的活性降低。这些表明，P.gingivalis发挥了至关重要的作用，并且可能是ESCC进展中NF-kB激活的重要刺激。NF-kB信号通路在调节对感染的免疫应答方面发挥着关键作用，并且该途径与ESCC发展有关[23,25]。总的来说，这些研究表明，P.gingivalis诱导的ESCC细胞的增殖迁移可能与NF-kB信号传导的激活有关，因此可作为ESCC的治疗干预的目标[23,26]。

4 P.gingivalis通过TGF-β依赖的Smad/YAP/TAZ信号促进ESCC的进展

P.gingivalis的内化通过转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)依赖的 Smads/YAP/TAZ (Yes-associated protein YAP65 homolog/Transcriptional coactivator with pdz binding motif)的激活，增强ESCC的侵袭和转移，从而诱导上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)[27]。P.gingivalis细胞内定植诱导的糖蛋白A重复序列(Glycoprotein-A repetitions predominant，GARP)上调加速TGFβ生物活性，推动ESCC进展和转移。其中，P.gingivalis还能诱导细胞周期抑制剂和凋亡相关基因的上调，表明TGFβ信号通路是一个中介。值得注意的是，与野生型P.gingivalis相比，fimbrillin A (fimA)缺乏的P.gingivalis表现出增殖能力、迁移能力、侵袭能力和细胞内侵袭能力以及Smad2/3磷酸化能力的下降[28]。提示FimA通过TGFβ/Smad信号通路部分参与P.gingivalis的肿瘤促进作用。值得注意的是，ESCC中牙龈链球菌的数量与GARP、pSmad2、YAP/TAZ、Snail、TGFβ1和Oct4蛋白水平呈正相关[29]。此外，GARP与pSmad2、pSmad2与YAP/TAZ、YAP/TAZ与Oct4均存在显著相关[30]。有证据表明，Hippo通路的效应子YAP/TAZ通过与Smads复合物结合，响应TGFβ来控制TGFβ/Smad信号通路[31]。此外，YAP/TAZ在ESCC中的致癌作用是必需的，因为YAP/TAZ缺失或YAP S94A/TAZ S51A突变体的过表达消除了P.gingivalis诱导的迁移、侵袭和转移。这些数据表明，P.gingivalis刺激的YAP/TAZ活性是TGFβ/Smads信号通路介导的P.gingivalis.肿瘤促进功能的必要前提，而YAP/TAZ核积累可以消除这一功能。总之，基于P.gingivalis诱导的ESCC进展的复杂通路，其阐明了TGF-β规范信号级联传导[29]。

5 P.gingivalis通过修饰多种凋亡和细胞周期信号通路提高ESCC细胞的生存能力

胞内P.gingivalis感染后，通过短时间内增加PI3K/Akt信号通路，促进上皮细胞的存活和增殖，从而抑制细胞凋亡。此外，P.gingivalis通过分泌其效应蛋白核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate Kinase，NDK)，阻断细胞外ATP/P2X7危险信号，保护自己和宿主上皮细胞免受线粒体和NOX2产生ROS的损害[32]。EMT是通过GSK3-β的失活而促进的[33]，GSK3-β通过增加Snail、Slug和β-catenin转录因子的表达和可用性促进E-cadherin向Vimentin的转换[34]。β-catenin还上调cyclin、ZEB1和MMPs，导致上皮细胞增殖和迁移增加[35]。P.gingivalis通过其效应蛋白NDK直接磷酸化HSP27，从而继续促进EMT，导致前MMP9水平的增加[36]。P.gingivalis增加了肿瘤干细胞标记物CD44和CD133的表达[37]。此外，P.gingivalis通过分泌细胞因子和趋化因子以及B7-H1和B7-DC受体的表达增加来调节免疫环境，导致活化的T细胞凋亡[38]。

信号传导及转录激活因子 (signal transducer and activator of transcription,STAT3)对于P.gingivalis介导的口腔上皮细胞耐化学诱导凋亡和ESCC的可控进展具有关键作用。与对照组相比，P.gingivalis感染增强了紫杉醇处理的细胞中STAT3的表达，但降低了caspase-3的表达。提示STAT3和caspase-3的差异调控是P.gingivalis蛋白诱导ESCC细胞抗凋亡的关键信号通路[28]。此外，WP1066对STAT3的化学抑制可导致细胞凋亡，并消除P.gingivalis对紫杉醇诱导的细胞凋亡抗性的影响[39]。此外，抑制STAT3使P.gingivalis蛋白在紫杉醇处理的细胞中减少caspase-3，表明STAT3和caspase-3之间可能存在连接。证明STAT3和caspase-3信号是P.gingivalis诱导的抗凋亡信号的重要组成部分[40-41]。P.gingivalis刺激显著增强了Cyclin D3和E1的表达。此外，P.gingivalis感染增强了KYSE30细胞中Thr 160处CDK2的磷酸化，这可以通过与cyclin蛋白结合增加活性并促进G1-S期转变和S期进展，表明P.gingivalis可以利用细胞周期机制加速ESCC细胞的增殖[6]。

6 P.gingivalis的IgA或IgG水平和ESCC患者的预后关系

ESCC患者中抗P.gingivalis的血清中位IgA和IgG水平显著高于食管炎患者和健康对照组。传统的ESCC血清标志物如鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)[42]、癌胚抗原(CEA)[43]、CYFRA21-1和糖类抗原CA199对ESCC的早期检测和进展没有足够的敏感性和特异性[9]。其中IgA对早期ESCC的诊断效果明显优于IgG (54.54% VS 20.45%)[9]。此外，血清中抗P.gingivalis的IgA或IgG水平高与ESCC患者的预后较差相关，特别是在0～Ⅱ期或阴性淋巴结转移的患者。同时具有高IgA和IgG的患者预后最差。因此，结合IgA和IgG可以提高诊断，改善预后。P.gingivalis蛋白血清生物标志物对于早期检测ESCC具有重要意义，并可能提高诊断和预后性能[9]。

7 P.gingivalis引起的癌变也有助于潜在致癌物的代谢

乙醛(ACH)是酒精的第一代谢物，是人类的第一类致癌物[44]。与口腔卫生良好的个体相比，口腔卫生不良的受试者体外唾液乙酰胆碱产生量高出2倍。P.gingivalis将乙醇转化为乙醛，能够诱导DNA损伤、诱变和上皮细胞的增殖。这可能部分地有助于解释为什么酗酒和某些癌症相关[6,45]。

近几年来，微生物感染引起全身性疾病的发病率显著上升，但疾病与发病机制的相关性尚不清楚。微生物、炎症和宿主细胞代谢的调节都是致癌因素[46],但尚不清楚哪些因素起主导作用，以及它们之间存在怎样的相互作用。P.gingivalis感染与ESCC发生发展相关，并与ESCC患者预后不良相关。此外，在体外和体内，P.gingivalis感染促进ESCC细胞生长，并使肿瘤细胞对化疗诱导的凋亡产生抵抗。微生物可作为疾病诊断和监测的新的标志物。微生物在肿瘤发生过程中的特定靶点也可用于精确的靶向治疗[47]。进一步探讨P.gingivalis的发病机制，可以为癌症防治提供新的方向，提高患者的健康水平和生活质量。