HIPPO信号通路在心脏发育及疾病发生过程中的作用

赵南南 张洪亮

佳木斯大学附属第一医院，黑龙江省佳木斯市 154000

HIPPO信号通路成分首次在果蝇中被学者发现，由于其在生物发育过程中发挥重要作用，近年来逐渐成为研究热点。在哺乳动物体内HIPPO信号通路通过调节细胞增殖、凋亡、分化和干细胞自我更新来控制包括心脏在内的许多器官的发育和内稳态平衡[1]，其核心成分是高度保守的，由丝氨酸/苏氨酸激酶级联、转录协同激活因子和DNA结合蛋白组成。HIPPO通路在激酶级联激活后，蛋白激酶Mst1/2与适配器蛋白SALV相互作用，使许多蛋白质[包括SALV、大型肿瘤抑制因子(Lats1/2)和Lats1/2相互作用蛋白MOB1]发生磷酸化，进而抑制促生长活性激活蛋白(Yes-associated protein，YAP)和转录协同激活因子与PDZ结合基序(Taz)的活性，使Yap和Taz在细胞质内保留或降解。相反，当HIPPO通路上游激酶失活时将导致Yap和Taz向细胞核内转移，在细胞核内与包括Tead1-4在内的各种转录因子相互作用，诱导下游靶基因激活，产生促使细胞增殖、分化和迁移的作用[1]。综上所述，HIPPO信号通路的主要功能是调节细胞增殖、凋亡和分化和限制成年动物的器官和组织生长。

1 HIPPO通路与心脏发育

心脏是胚胎发育过程中形成的第一个有功能的器官。它通过血管将充满氧气和营养物质的血液输送到组织，以满足其他器官发育。心脏发育不完全则不能向机体输送足够的血液，从而导致机体病理改变。Hippo信号通路在心肌三层结构(心肌层、心外膜层和心内膜层)的细胞中均有表达，在心脏发育过程中发挥着重要作用。

1.1 HIPPO通路与心肌 心肌细胞的增殖对心肌的正常生长至关重要。研究表明，Hippo信号通路在心脏发育过程中通过调节心肌细胞增殖来维持哺乳动物心脏的正常大小[2-4]。为了研究Hippo通路在心脏发育中的作用，Heallen等人采用基因失活的方法删除胚胎小鼠心脏中的SALV、Mst1/2和Lats2，结果发现在这些突变体中心脏的整体模式不变，但是出现心肌细胞增殖、小梁扩张和心肌增厚，最终导致心脏异常增大[2]。Xin等人研究发现YAP缺失可导致心肌细胞增殖受损，发生致死性心脏发育不良和心肌层严重变薄；相反，心肌细胞特异性活化的YAP(YapS112A)的过度表达会导致心肌细胞增殖增强，进而导致新生小鼠心脏过度生长[3]。von Gise等人使用Tnnt2Cre系诱导活化的Yap(YapS127A) 过度表达出现外周出血、心脏肿大和剧烈的心肌过度生长导致心腔闭塞，最终导致E15.5的胚胎死亡[4]。Monroe等人研究发现在成人心肌细胞中过度表达活化的YAP(αMHCCre-ERT2；YAP5SA)导致增殖增加，进而导致心室壁增厚和心功能改善，且Yap5SA过表达可通过增加胚胎心脏增强剂在成人心脏中的可及性，诱导成人心肌细胞进入胚胎细胞状态[5]。这些研究表明，YAP在心脏发育过程中发挥着促进心肌细胞增殖、组织生长、心脏增大的调节作用。与Yap在心脏中公认的作用相反，Taz的作用还没有被广泛研究。最近，Xin等人发现敲除小鼠心脏特异性Taz基因是可行的，且不显示任何明显的心脏缺陷。但是，心肌细胞中Taz和Yap缺失的不同组合会导致基因剂量依赖性心脏缺陷，且Yap/Taz突变导致的心脏缺陷也与心肌细胞增殖增加和凋亡减少有关[6]。这说明Taz在心脏发育过程中也发挥着一定作用，但具体机制有待于进一步证实。TEAD家族转录因子通过Yap/Taz中的N端TEAD结合域与Yap和Taz相互作用。当Tead1位点被逆转录病毒基因捕获而破坏时，出现心室壁变薄、心包腔增大、心动过缓和胚胎致死。同时有研究表明，Tead1在小鼠心脏中的过度表达可导致心肌病和心力衰竭。这表明Tead1对于正常的心脏发育也是至关重要的。

1.2 HIPPO通路与心外膜 心外膜是心脏最外层的间皮细胞层，在心脏发育中心外膜衍生细胞(EPDCs)可以分化为血管平滑肌细胞、冠状动脉内皮细胞和间质成纤维细胞，故心外膜对于冠状血管的正确形成是必不可少的[7]。心外膜是基础心肌细胞增殖和分化所需的生长信号的重要来源。同时，心外膜细胞的行为也受来自心肌的信号调节。为明确HIPPO信号通路在冠状动脉血管发育中的作用，Singh等人构建了心外膜特异性Yap/Taz双突变胚胎模型，在该模型中观察到胚胎的心肌薄而易碎，出现出血，最终在E11.5～E12.5左右死于心血管功能不全[8]。发生上述病理改变时由于心外膜中的Yap/Taz缺失，心外膜—心肌信号转导受到损害，心外膜细胞增殖、上皮细胞向间充质细胞转化和EPDCs分化为心脏其他细胞均受到影响。Xiao等人研究发现心外膜中Hippo通路的激酶Lats1/2的特异性缺失的胚胎中出现冠状动脉血管重塑缺陷，导致E15.5的胚胎死亡，他们利用单细胞RNA测序方法进一步分析发现心外膜细胞中Lats1/2缺失抑制新外膜细胞向成纤维细胞分化，使其保持在具有心外膜细胞和成纤维细胞特征的中间细胞状态。这些结果表明，Lats1/2在EPDCs从心外膜来源的祖细胞向完全分化的心脏成纤维细胞进展过程中发挥重要作用[9]。综上所述，心外膜中的Hippo信号通路对于心外膜细胞向成纤维细胞分化和冠状动脉血管发育是必需的。

1.3 HIPPO通路与心内膜 心肌的生长和成熟是由邻近的心内膜细胞发出的信号编码的[10]。在心脏发育中，心内膜细胞分泌中性调节蛋白1(Nrg1)并表达细胞表面配体Ephrin B2(Efnb2)，二者均向相邻的心肌细胞发出信号以促进心肌生长和成熟。在心脏发育过程中Yap和Taz在心肌和心内膜细胞中均有表达[11]。Artapet等人研究发现在敲除心内膜特异性Yap和Taz后，可在Yap/ Taz双突变胚胎中观察到Nrg1表达水平降低，心室壁厚度减少，个体出生后死亡率增加；当添加外源性重组Nrg1时，突变体心脏致密薄层心肌可被挽救[11]。上述结果说明Yap/Taz通过介导心内膜中Nrg1的调节在心肌发育中发挥重要作用，故Hippo信号通路是心内膜/内皮细胞调节正常心脏发育所必需的。

2 HIPPO通路与心脏再生

在发生心肌损伤时成人心脏再生能力是有限的，而新生小鼠心脏能够完全再生，但是这种完全再生的能力在出生后第7天(P7)就会丧失。由于Hippo信号转导为胚胎发育期间心肌细胞增殖提供重要调节因子，故我们猜测Hippo通路在心脏再生/修复中也可能发挥重要作用。研究发现YAP过度表达可延长新生儿心肌细胞活动周期并促进再生，表明Hippo信号通路对出生后心脏的心肌细胞增殖也具有重要作用[4]。Xin等人通过观察结扎后心脏的缺血区域发现：来自P2新生野生型小鼠的心脏在心肌损伤后仅出现极小的纤维化，这说明P2野生型小鼠的心脏在心肌损伤后可完全再生；相反，P2的YAP缺失的突变体小鼠心肌损伤后显示出广泛的心脏纤维化，表明YAP缺失时心肌再生反应受损[6]。为了进一步证明YAP激活对于出生后心脏再生的影响，Xin等人在αMhc启动子的控制下过表达的活化的YAP，构建出αMHC-YapS112A转基因小鼠模型。并使野生型和αMHC-YapS112A转基因小鼠均在P7受到心肌损伤，并在P21进行分析。结果发现：野生型小鼠在损伤后表现出广泛的瘢痕形成，心肌组织丢失和心室扩张；而αMHC-YapS112A心脏完全再生，几乎没有纤维化[6]。

综上所述，在心脏损伤后的再生过程中Hippo信号通路各组件发挥重要作用且 YAP 活性的平衡对心肌损伤后再生有意义。故Hippo-YAP信号通路在心肌损伤后再生过程中发挥重要调控作用。

3 HIPPO通路与心脏疾病

Hippo信号通路与各种心脏异常有关，包括心肌肥大、心力衰竭、致心律失常性心肌病、扩张型心肌病和缺血性心脏病等。

3.1 心肌肥厚 在心脏发育中，心肌细胞增殖扮演着重要角色。然而，由于成年心肌细胞增殖能力有限，出生后心脏生长主要受心肌细胞生理性肥大的控制。除生理性肥大外，心肌肥厚还可由多种病理条件引起。如心肌缺血/再灌注(I/R)损伤和心肌梗死(MI)可导致氧化应激和不可逆的心肌细胞损失，最终导致心力衰竭。机体为适应这些不利条件导致的心肌收缩力不足出现心室肌细胞肥大，从而增加壁厚、减少壁应力及细胞死亡。在生理和病理条件下YAP激活可在不影响心肌细胞大小的前提下增加胚胎和出生后心肌细胞的增殖[4]。YAP激活后通过促进心肌细胞存活、增殖和肥大来保护心脏不受心肌梗死的影响。且有研究表明Yap激活导致的心肌细胞存活由AKT和或miR-206共同介导的，而其对肥大的影响仅由miR-206介导[12]。有学者研究发现肥厚型心肌病患者的心脏标本、横行主动脉缩窄(TAC)继发性肥大反应期间的小鼠中YAP表达均增加，并且人的心肌细胞特异性YAP在体外和体内过度表达都诱导了肥大[13]。以上研究说明YAP在心肌肥厚过程发挥重要作用。

Hippo信号通路上游激酶的抑制或缺失可诱导YAP的核蓄积从而调控心肌肥大。在I/R损伤、心肌梗死和压力过载时Mst1也被激活。Del Re等人研究发现Mst1的生理性激活剂Ras相关结构域家族1亚型A(Rassf1A)的升高与心肌细胞凋亡和心肌肥大相关，Rassf1A在小鼠心脏中的表达在1周时开始增加，但在12周TAC诱导心脏肥大后降低[14]。当心肌细胞特异性消融Rassf1a或过表达Mst1结合突变型Rassf1A时可减少TAC诱导的小鼠心肌肥大和纤维化[14]。上述结果说明Mst1是心肌肥大的负调控因子。Matsui等人发现， Lats2在小鼠压力超载时也上调，但其过度表达并不影响心肌细胞凋亡，而是使心肌细胞减小[15]。心肌细胞特异性的显性阴性形式Lats2(抑制内源性Lats2)的过度表达显著增加心室肥厚并抑制TAC诱导的心肌细胞凋亡[15]。故Lats2也是心肌肥大的负调控因子。综上所述，Hippo途径及其各组分在调节心肌肥大方面发挥着重要作用。

3.2 缺血性心肌损伤与扩张型心肌病 缺血再灌注损伤是人类心功能不全最常见的原因之一。心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞的死亡在很大程度上是由于活性氧(ROS)的过度产生和细胞死亡途径的激活所致。近年来Hippo信号通路在调节心肌细胞凋亡中的作用已被广泛研究。Hippo通路的激酶Mst1在心肌细胞中可被两种机制激活：白屈菜红素通过caspase依赖的裂解激活Mst1，而calyculin A通过磷酸化激活全长形式的Mst1。当心脏出现I/R损伤时引起氧化应激通过上述两种机制激活Mst1，Mst1被激活后在小鼠的心脏中特异性过度表达导致凋亡相关蛋白酶激活，进而出现心肌细胞凋亡增加、心脏扩张、心功能恶化，最终导致死亡。综上所述，Mst1的激活与心肌细胞凋亡密切相关。

神经纤维蛋白2(NF2)是一种GTP酶激活蛋白，调节RAS信号通路。据报道，在I/R损伤时NF2被激活从而可以调节Mst1和Lats2介导的心肌细胞凋亡[16]。杜氏肌营养不良症(DMD)是一种进行性肌无力为主要表现的疾病，可引起扩张型心肌病、心力衰竭和心肌纤维化。DMD是由肌萎缩蛋白基因(MDX)的功能丧失或突变引起的。为了证明Hippo信号通路在扩张型心肌病中的作用，Morikawa等人构建了MDX单基因敲除和Sav1、MDX双基因敲除的小鼠模型，并在形成扩张型心肌病超载模型后对它们进行了分析，结果发现MDX单基因敲除小鼠心脏心肌细胞丢失，纤维化增加，发展成扩张型心肌病，且心脏功能受损。相反，在MDX基因敲除基础上Hippo通路的失活(SAV1、MDX双敲除)通过增加YAP活性来保护心脏免受扩张型心肌病的影响，从而增加心肌细胞增殖并减少凋亡[17]。

3.3 心律失常性心肌病 致心律失常性右室心肌病(ARVC)是一种原发性遗传性心肌疾病，以右室心肌不同程度地被纤维脂肪组织替代为主要特征，往往伴有心室扩大、心力衰竭、严重恶性心律失常甚至猝死发生。Wnt/β-catenin信号通路调控心源性祖细胞向心肌细胞和脂肪细胞分化。Hippo通路在致心律失常性心肌病的人类心脏和小鼠模型中被激活。Chen等人研究发现在人类晚期致心律失常性心肌病患者中间盘蛋白的表达明显降低，这些变化导致蛋白激酶C-α(pkcα)的定位减少，pkcα使NF2磷酸化并失活的作用减弱，因此，在致心律失常性心肌病的患者和临床前小鼠模型的心脏样本中可观察到NF2的高表达[18]。NF2的激活导致Hippo成分Mst1/2，Lats1/2和Yap的磷酸化，抑制Yap-tead靶基因的表达。由于Wnt/β-catenin 和Hippo信号通路有交互作用，两条通路中YAP, PG(γ-catenin)及β-catenin相互作用形成蛋白复来发挥作用，所以虽然总β-catenin水平没有改变，但β-catenin在插入盘上的定位受到影响，导致Wnt/β-catenin转录活性降低[18]。综上所述， Wnt/β-catenin激活和Hippo-Yap信号通路的降低与致心律失常性心肌病中心肌脂肪化有关。

3.4 心肌梗死后炎症反应及心肌重塑 Hippo通路成分在心脏发育、再生和内稳态中发挥重要作用已被广泛研究。最新进展表明，Hippo信号成分也参与调节炎症过程，包括免疫反应。Hippo信号成分在调节不同病理生理学条件下的炎症反应方面的作用已经确立，但它们在调节MI后炎症和重塑中的作用尚未得到充分研究。

研究表明，心肌梗死后心外膜重新激活，重新激活的心外膜细胞表达的基因通常为在胚胎时心外膜中表达的。这些心外膜细胞也会增殖并覆盖受损组织。活化的心外膜细胞经过EMT分化为成纤维细胞和平滑肌细胞，这进一步促进了修复过程。在心脏损伤时，心外膜也分泌血管生成因子和炎症因子，从而增加炎症细胞流入梗死区。Treg细胞已可降低损伤后心肌的免疫反应和梗死疤痕大小[19]。最近，Ramjee等人的研究表明，心外膜中的Hippo信号通路通过募集调节性T细胞(Treg)到受损心肌中，在心肌损伤后的恢复中发挥作用，由于在损伤心肌中Treg细胞数量减少，导致Yap和Taz的心外膜特异性缺失出现严重的损伤后心包炎和心室纤维化，进而导致心肌病发生率和死亡率增加。此外，YAP/TAZ还调节激活的心外膜中干扰素-γ的表达，当使用水凝胶外源性给予干扰素-γ时可改善Treg细胞向受损心肌的浸润，并减少了心室纤维化[20]。尽管对Hippo信号在非免疫细胞相关炎症反应中的作用进行了广泛研究，但其在免疫细胞中的功能尚未建立[21]。这些结果表明，Hippo通路成分可能通过调节心肌梗死后的炎症反应，控制不利的重塑、促进心肌梗死后心功能的恢复，在炎症细胞中发挥着重要作用。

4 结论

Hippo信号通路已经成为心脏发育、生长和损伤后再生/修复的重要调节因子。在动物模型中，删除Hippo成分Sav1或激活YAP可改善心肌梗死后的心功能和心肌存活[22]。这表明Hippo信号通路有可能被用作促进心脏损伤后再生/修复的靶点。一些研究结果表明，长期的YAP激活可能对心脏产生不利影响[5]。这表明虽然YAP激活似乎有短期的有益影响，但其对Hippo信号通路和心脏损伤的长期后果仍有待阐明。需要严格控制心肌细胞中的YAP激活，以获得改善损伤后心功能的有益效果，而不会产生重大不良反应。尽管Hippo信号通路在心肌细胞中已被广泛研究，但其在药物性心肌损害，如阿霉素心肌损害中未能得到很好的描述。阿霉素是目前疗效最好的抗肿瘤药物之一，其应用受到限制的主要原因就是心脏毒性，因此有必要进行进一步的研究，以更好地了解Hippo信号通路如何在开发无潜在副作用的治疗干预中对它们进行调节。