基因测序诊断遗传性高胆红素血症的研究进展

李 伟

（天津和平新世纪妇儿医院儿内科，天津 300041）

遗传性高胆红素血症（hereditary hyperbilirubinemia）是一类常染色体遗传病，由于基因缺陷导致胆红素代谢障碍，从而引起胆红素增高的临床综合征，有家族聚集性。根据胆红素增高的种类不同，可分为遗传性高直接胆红素血症和遗传性高间接胆红素血症。该类疾病均以黄疸为主要表现，临床表现及相关化验室检查缺乏特异性，故对于婴幼儿、青少年或是成年人，以间歇性或长期反复出现的黄疸为主要表现，实验室检查结果仅提示胆红素升高，而不伴丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferse，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷氨酰胺转移酶（transglutaminase，GGT）等其他酶学异常，在除溶血性因素及肝胆系统其他疾病后，临床即可做出初步判断，根据患者胆红素增高的种类及程度，进行针对性的基因测序，以提高确诊率。本文就遗传性高直接胆红素血症及遗传性高间接胆红素血症概述及各型相关基因突变及治疗进展进行综述，以期为临床治疗提供参考。

1 遗传性高直接胆红素血症概述

遗传性高直接胆红素血症包含2 个亚型，即Dubin-Johnson 综合征（Dubin-Johnson syndrome，DJS）及Rotor 综合征（Rotor syndrome，RS）。DJS 由Dubin 和Johnson 于1954 年首次发现并报道的常染色体隐性遗传病。DJS 及RS 临床上以长期或间歇性结合胆红素升高为主要表现[1]，实验室检查缺乏特异性，诊断较为困难。肝组织活检为二者鉴别诊断的主要依据，DJS 肝穿刺活检可见肝组织呈黑色、棕褐色或褐墨绿色，肝细胞内可有大量褐色色素沉着。在电镜下，褐色色素颗粒通常包括3 种成分，分别是沉积有铁蛋白样的基质、电子致密体和脂样小滴。通过超微结构发现颗粒内含致密核心结构溶酶体，其被认为是DJS 超微结构特征，可与其他高胆红素血症相鉴别[2]。RS 肝组织颜色正常，肝细胞内无色素沉着。随着基因检测技术的发展进步，基因测序成为疾病诊断的首选方案。

1.1 ABCC2 基因突变 研究发现[3]，DJS 患者存在ABCC2 基因突变。该基因位于人类10 号染色体短臂24 区（10q24），当发生基因突变时，导致多药耐药相关蛋白（MRP2）功能障碍或缺失，使得间接胆红素在肝细胞内微粒体中形成直接胆红素后，在肝细胞内转运和向毛细胆管排泌发生障碍，造成慢性良性间歇性黄疸。目前已报道DJS 相关的ABCC2 基因突变位点多达68 个，包括错义突变、无义突变、剪接突变、调节突变、删除/缺失突变、插入突变、复杂重排突变等。2018 年，Wu L 等[4]首次报道了我国DJS患者的ABCC2 基因突变模式，该研究对7 例临床确诊患者的所有32 个外显子和邻近的剪接区域都进行了测序，报道的新型突变包括p.G693R、p.G808V、p.E647X、p.G693R 及p.E647X，且突变均为杂合突变，其中1 例出现复合杂合突变（p.G693R/p.G808V），而其他患者只携带一种单一突变，肝脏活检的免疫组化结果证实了新型无义突变p.E647X导致MRP2 膜表达缺失。Corpechot C 等[5]对32 例临床诊断DJS 的患者进行基因测序研究，其中30 例患者ABCC2 基因存在大量的点突变和拷贝数突变，这些患者中有8 例（27%）表现出短暂的胆汁淤积症状，分别为4 例新生儿胆汁淤积、2 例ICP、1 例避孕药引起的胆汁淤积和1 例散发性胆汁淤积。故，基因检测对早期诊断新生儿胆汁淤积等不典型表现的DJS 患者至关重要。

1.2 SLCO1B 基因突变 SLCO1B 基因突变为RS 的致病原因，双等位基因SLCO1B1、SLCO1B3 位于12号染色体上（12q12.1，12q12.2），由于溶质载体有机阴离子载体1B1/3（SLCO1B1/3）双等位基因突变，导致有机阴离子转运多肽（OATP1B）功能缺陷，OATP1B1 和OATP1B3 同时缺乏[6]，继而引起肝细胞分泌功能缺陷和肝内处理胆红素能力下降，使血清内结合胆红素和非结合胆红素均增高。目前，人类基因库中共收录了SLCO1B1 突变26 种，以错义突变和无义突变为主；SLCO1B3 基因突变10 种，均为错义突变。白洁等[7]通过对SLCO1B1 及SLCO1B3 基因测序进行分析得出，较为常见的突变位点为SLCO1B1 基因的错义突变 c.1738C ＞T 以及SLCO1B3 基因的IVS13+1G＞A。另有研究发现[6，8]，在部分RS 患者中有逆转录转座子LINE-1 插入到了SLCO1B 基因中，LINE-1 可调节基因的表达，使得外显子发生倒置或跳跃，从而引起疾病的发生。这个新的发现为RS 的发病机制、诊断及治疗都提供了新的方向。

1.3 DJS 及RS 的治疗 DJS 患者的主要症状为黄疸、高胆红素血症，部分患者会伴有胆汁淤积，生化指标可存在ALT、AST、GGT、胆汁酸等异常，但目前导致胆汁淤积症的机制尚不明确，多数患者无需药物治疗；而当合并胆汁淤积时，可给予熊去氧胆酸等药物对症治疗[9]。RS 患者肝功能正常，预后良好，一般无需给予特殊治疗，病情不会恶化，远期不会发展为肝癌或者肝硬化等[10，11]。因此，在临床工作中，对于反复出现的以直接胆红素增高为主要表现的黄疸患者，而临床缺乏其他特异性表现，应积极进行针对性的基因检测，在明确诊断为DJS 或者RS 后，无需反复的检查及药物治疗，这为临床工作者制定规范的诊疗提供了帮助，同时为这类疾病的患者减轻了痛苦及经济负担。

2 遗传性高间接胆红素血症概述

遗传性高间接胆红素血症，其特点为血清总胆红素增高，以间接胆红素增高为主，包括Gilbert 综合征（Gilbert syndrome，GS）、Crigler-Najjar 综合征Ⅰ型（Crigler-Najjar syndrome Ⅰ，CNS-Ⅰ）、Crigler-Najjar综合征Ⅱ型（Crigler-Najjar syndrome Ⅱ，CNS-Ⅱ）。

2.1 UGT1A1 基因突变 研究发现[12]，GS、CNS-Ⅰ及CNS-Ⅱ均与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）基因突变有关。UGT 酶负责胆红素的葡萄糖醛酸化过程，使其代谢产物更容易通过尿、胆道排出体外[13]。而当UGT1A1 基因发生突变时，该酶活性部分或者完全缺失，从而导致间接胆红素增高。该酶的编码基因位于人类2 号染色体的长臂37区（2q37），是由4 个共同外显子及1 个可变的第一外显子构成的。梁晨等[14]通过总结共发现UGT1A1突变位点163 个，突变类型有错义突变、无义突变、缺失突变及移码突变等，且患者血清胆红素水平的高低及复杂的遗传性状与UGT1A1 突变位点或互相组合的多态性相关。GNS 根据其分子和功能特征、临床表现的严重程度、苯巴比妥反应等临床标准分为两类，Ⅰ型是最严重的，几乎完全缺乏UGT 酶活性，主要累及中枢神经系统并发核黄斑，而Ⅱ型相对轻，酶活性水平较低[15]。CNS-Ⅰ患者的致病基因突变位于UGT1A1 2～5 号外显子，以无义突变、错义突变为主，此外，部分移码突变，比如位于1 号外显子的65delC 以及4 号外显子的1220delA也可导致CNS-Ⅰ型发病[16-18]。此型发病率极低，多在新生儿期起病，表现为UGT 酶活性完全或严重缺乏、出现严重黄疸，极易导致核黄疸，患儿预后差，多于婴幼儿期死亡。

GS 及CNS-Ⅱ常见的基因突变位点类似，以点突变为主，尤其是以单碱基替代错义突变为主，常见的突变位点为1 号外显子错义突变c.211G＞A 和5号外显子c.1456T＞G[13，19]。此种突变类型对酶活性影响较小，因此黄疸相对较轻，预后良好。通过对GS及CNS-Ⅱ表型复合杂合突变基因位点进行分析总结发现，一条染色体某个区域突变可能容易与另外一条染色体的某个特定区域突变位点形成复合杂合突变；同时，GS、CNS 不同疾病表型中外显子基因突变数目与外显子长度呈正相关，即随着外显子碱基序列数量增多，突变位点数目也会增多，但与疾病的表型无关[14]。Maruo Y 等[12]对日本163 例CNS-Ⅱ或GS 患者的基因型和表型进行分析后发现，绝大多数患者存在UGT1A1 双等位基因突变，其中78.5%存在多重突变，典型的CNS-Ⅱ为纯合双错义突变p.[G71R:Y486D]，并在典型的GS 患者中检测到4 种基因型，即纯合子型UGT1A1*28、UGT1A1*6/UGT1A1*28、纯合子型UGT1A1*6 及UGT1A1*27/UGT1A1*28。宋金云等[20]研究报道，GS 患者的UTG1A1 基因突变主要有3 种类型，即启动子区域TA 盒中TA 碱基序列插入突变、外显子区域单碱基突变以及远端加强序列苯巴比妥反应增强原件的突变。Chiddarwar AS 等[21]在GS 患者中发现了7 种不同的序列变异，在7 个变异中UGT1A1 基因存在6个错义突变和1 个沉默的单核苷酸替换，表明UGT1A1 基因存在不同的变异，特别是H55R 变异对胆红素水平有显著影响，可能是高胆红素血症的遗传危险因素。Radoi VE 等[22]对罗马尼亚897 名受试者进行了研究，包括292 例GS 患者和605 名健康对照者，旨在筛选出在UGT1A1 基因TATA 盒区存在（TA）插入的患者，结果发现UGT1A1*28（7TA）等位基因频率最高，为61.87%；其次是UGT1A1*1（6TA），为36.79%；同时该研究还发现了UGT1A1基因的另外两种变异，5TA（0.61%）和8TA（0.72%）；在所有UGT1A1 基因突变阳性患者中，32.33%为TA 7/7 纯合型，其中TA 6/7 杂合型占57.64%、野生型（TA）6/6 占7.36%，表明罗马尼亚人群中UGT1A1*28 多态性与GS 患者的高胆红素血症有很强的相关性。Mi XX 等[23]对我国东南部高胆红素血症患者UGT1A1 基因型进行了研究，结果发现GS患者85%（47/55）存在致病性变异UGT1A1*60，而且在UGT1A1 的启动子区域检测到了UGT1A1*28和UGT1A1*81；同时，在UGT1A1 中均出现多个变异位点，而变异数与胆红素水平无关。由上述研究分析得出，UGT1A1 基因突变后引起UGT 酶活性发生改变，而此酶的活性降低的程度受UGT1A1 基因突变发生的位置、突变类型以及多态性等多方面的因素共同影响，从而表现出黄疸的严重程度不同。

2.2 基因突变类型与疾病相关性 Sun L 等[24]对95例遗传性高间接胆红素血症的患者进行研究，结果共检测到6 个位点的192 个UGT1A1 突变，其中UGT1A1 中的连锁多态性突变A（TA）7TAA 和c.-3279T＞G 与GS 的相关性最强，而编码区突变p.G71R 和p.Y486D 与CNS-II 的相关性最强。另外，Moyer AM 等[25]对346 例高胆红素血症的儿童患者进行了UGT1A1 基因测序分析，结果发现新生儿（年龄≤28 d）UGT1A1 变异发生频率（31.3%）年龄较大的儿童（1～18 岁）变异发生率（85.1%）低，并鉴定出了C.337t＞G（p.Y113D）、C.1037c＞A（p.A346E）和C.1469a＞C（p.D490A）3 个新变种，同时在年龄较大儿童中UGT1A1 基因分析证实了79.0%的患儿为GS。梁晨等[14]研究发现，亚洲地区报道的UGT1A1基因突变位点在c.211-c.558 有明显的聚集，其次的高频突变是UGT1A1*28、UGT1A1*60，其中CNS-Ⅱ型高频突变位点是c.1456T＞G、c.625C＞T（UGT1A1*8）。通过总结各文献，结合患者胆红素水平，建议对有c.211G＞A、UGT1A1*60、UGT1A1*28基因突变的患者，优先考虑将GS 作为初步诊断。对有两个及以上的基因突变位点，尤其其中一个包括c.1456T＞G、c.625C＞T 的患者，可优先考虑将CNS-Ⅱ型作为初步诊断。这些基因测序的研究进展，为临床工作者对该类疾病的诊断提供了重要思路及指导。

2.3 GS、CNS-Ⅰ及CNS-Ⅱ的治疗 GS 及CNS-Ⅱ均为良性疾病[26]，预后良好，轻度的胆红素增高一般无需特殊处理，必要时可给予口服苯巴比妥或光疗等对症治疗。而CNS-Ⅰ则多于新生儿期起病，且黄疸严重，此类患者对苯巴比妥治疗无反应，极易导致核黄疸，如果不及时治疗，几乎都会死于胆红素脑病，预后差。有研究发现[27]，在CNS-Ⅰ患者中，胆红素水平在新生儿时期增加3～6 mg/（dl·d），并在5～14 d 达到神经危险水平。目前，光疗仍是该疾病的主要治疗方法，但尽管有持续的光疗，CNS-Ⅰ患者随着年龄的增长，高胆红素血症会恶化，而肝移植是当下CNS-Ⅰ唯一的最终治疗方法，但也会带来高昂的费用、内科和外科的发病率以及免疫抑制的风险。Apgar JF 等[28]研究给患有CNS-Ⅰ的小鼠体内注射脂质纳米颗粒包裹的hUGT1A1-modRNA，结果发现该患病小鼠UGT1A1 基因可以重新表达，其血清胆红素水平也降至正常水平。另外，Ebrahimi A 等[29]也利用腺病毒等重组病毒的基因转移载体成功地将UGT1A1 基因转移到Gunn 大鼠CNS 模型的肝脏中。基于动物模型的前景，基因治疗方法有望继续用于人类临床前研究，甚至成为未来10 年内CNS 的一种现实治疗模式。

3 总结

遗传性高胆红素血症是一类常染色体遗传病，近几年的研究已经取得了较大的进展，提高了临床工作者对此类疾病的认识，但是部分疾病的发病机制尚不明确。此类疾病其临床表现及相关化验室检查均缺乏特异性，在日常的临床工作中诊断及治疗均有困难，基因测序是非常重要的诊断方法。在做好产前咨询及预防的基础上，对于新生儿高胆红素血症及其高危因素的早期识别及干预尤为重要。对于以间歇性或长期反复出现的黄疸为主要表现，而实验室检查无明显阳性者，结合血清胆红素增高的种类及水平，尽早进行针对性的基因测序，做到早期诊断，并根据不同病因，给予及时、适当的治疗，可减少不必要的治疗，给患者及家属减轻痛苦及经济负担。