子宫内膜微生物群及肠道菌群与复发性流产的相关性分析

夏美艳，朱 敏，黄亚雄

(1.湖北医药学院附属东风医院妇产科，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院基础医学院，湖北 十堰 442000)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指和同一个伴侣连续2次及以上妊娠停止，其病因复杂，与环境、人为、遗传等因素有关。RSA是妊娠期常见的并发症，在育龄期女性中有1%～5%的发病率，且随着流产次数的增加，复发的风险也会增加[1]。有研究表明，RSA患者再次妊娠后，其自然流产率可达到70%～80%[2]。既往认为子宫是无菌的，但随着测序技术的发展，发现子宫内膜中存在微生物群。有研究证实，子宫内膜存在微生物群和胎盘共生定植[3-4]。人体生理代谢不仅受控于自身基因，还受控于肠道菌群，肠道菌群的平衡与人体健康有关。肠道菌群在人体吸收和转化营养物质中起到重要作用，与胃肠道疾病、妇科疾病密切相关[5-6]。但是对于子宫内膜微生物群及肠道菌群与RSA的相关性，目前尚无深入研究。基于此，本文以RSA患者为研究对象，分析子宫内膜微生物群及肠道菌群与RSA的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至12月在湖北医药学院附属东风医院因稽留流产行清宫术的RSA患者63例为流产组，选取同期因早孕要求终止妊娠行人流术的患者60例为对照组，选取同期因子宫肌瘤等行盆腔内手术且术中未发现有子宫内膜异位症病灶的患者53例为正常组。本研究通过伦理审核，所有研究对象均知情同意，自愿参加。纳入标准：①既往有2次及以上自然流产，且夫妻双方的染色体检查、生殖器检查均为正常，诊断为RSA；②育龄期女性；③身体质量指数(body mass index，BMI)在18.5～23.9kg/m2(正常范围)。排除标准：①人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、丙肝病毒(hepatitis C surface antigen，HCV)等检查异常；②抗子宫内膜抗体、抗精子抗体、抗心磷脂抗体均呈阴性；③近3个月内使用过抗生素；④近3个月内使用过避孕药等糖皮质激素或者性激素；⑤泌尿生殖道炎症或者是其他感染性疾病；⑥肝炎、糖尿病或者是其他自身免疫性疾病。

1.2 方法

1.2.1子宫内膜微生物群的检测

流产组在清宫术后、对照组在人流术后分别取蜕膜组织分泌物，正常组在盆腔内手术后使用临床阴拭子蘸取子宫内膜处分泌物，迅速将采集的样本放置于无菌试管，-80℃保存备测。采用扩增子16SrRNA基因测序技术检测微生物群，PCR扩增阴道拭子样品的16SrRNAV46保守区，将PCR终产物经过Illumina NextSeq 550AR测序平台进行PE100-bp测序后，得到高通量下机原始碱基序列，采用QIIME分析生物信息学及测序数据，根据OUT分类进行结果鉴定。

1.2.2肠道菌群的检测

在手术当天采集患者3g新鲜粪便，采用光冈法获取1g标本，将标本置于厌氧菌中进行稀释，采用振荡器进行快速匀浆，再用生理盐水逐次将标本稀释呈1×10-8倍，选取50μL的标本，将其涂抹在乳杆菌和双歧杆菌的培养基上，在温度为37℃的温箱中进行48h培养，然后再进行定性和定量处理。再选取1g的标本，将标本置于需氧菌中进行稀释，选取50μL的标本，将其涂抹在酵母菌、肠球菌、肠杆菌的培养基上，在温度为37℃的温箱中进行48h培养，然后再进行定性和定量处理。菌落数采用lgCFU/g表示。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组一般资料的比较

三组的年龄、BMI、月经周期比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 三组一般资料的比较结果

2.2 各组子宫内膜微生物群的比较

三组的变形菌门、异常球菌-栖热菌门、大肠埃希菌/志贺菌属分布差异均有统计学意义(P<0.05)；流产组和对照组的变形菌门分布均明显高于正常组(χ2值分别为4.251、7.155，P<0.05)，异常球菌-栖热菌门分布均明显低于正常组(χ2值分别为4.634、5.965，P<0.05)，对照组的大肠埃希菌/志贺菌属分布明显低于正常组(χ2=7.062，P<0.05)，见表2。

表2 三组子宫内膜微生物群分布的比较结果[n(%)]

2.3 各组肠道菌群含量的比较

三组的酵母菌、肠球菌、肠杆菌含量比较均为流产组>对照组>正常组，三组的乳杆菌、双歧杆菌含量比较均为正常组>对照组>流产组，差异均有统计学意义(P<0.05)；流产组的酵母菌、肠球菌、乳杆菌、肠杆菌、双歧杆菌含量与对照组比较差异均有统计学意义(t值分别为8.148、3.677、7.002、3.895、11.135，P<0.05)，流产组的酵母菌、肠球菌、乳杆菌、肠杆菌、双歧杆菌含量与正常组比较差异均有统计学意义(t值分别为13.053、11.474、9.572、8.755、12.159，P<0.05)，对照组的酵母菌、肠球菌、乳杆菌、肠杆菌、双歧杆菌含量与正常组比较差异均有统计学意义(t值分别为5.286、8.948、2.845、7.714、5.732，P<0.05)，见表3。

表3 三组肠道菌群含量的比较结果

2.4子宫内膜微生物群和肠道菌群与RSA的相关性分析

经Kendall′s tau-b分析，子宫内膜微生物群的变形菌门与RSA呈正相关(P<0.05)，异常球菌-栖热菌门与RSA呈负相关(P<0.05)；经Spearman分析，肠道菌群的酵母菌、肠球菌、肠杆菌与RSA均呈正相关(P<0.05)，乳杆菌、双歧杆菌与RSA均呈负相关(P<0.05)，见表4。

表4 子宫内膜微生物群及肠道菌群与RSA的相关性分析结果

3 讨论

3.1 RSA的发病机制

RSA是常见的育龄期女性疾病，随着女性压力的增加，其发病率也不断升高，其中不明原因RSA的发生率也逐渐升高，可对女性身心健康造成严重的影响。RSA发病原因十分复杂，与环境、内分泌、染色体异常、感染等因素有关，其中环境、父方、母体、胚胎是导致流产的主要因素[7-8]。因此，明确RSA发病原因，寻找潜在的治疗靶点，对早期诊断、提高有效的治疗尤为重要。

3.2 子宫内膜微生物群与RSA的相关性

既往已经发现，在女性阴道中存在微生物，但通常认为子宫腔是无菌器官，即胎儿是在无菌环境中长大的。有研究认为，子宫内膜的微生物可能来源于阴道微生物上行，经阴道放置宫内节育器或者是采取辅助生殖技术治疗，都有可能使阴道的微生物进入到子宫[9]。很多微生物和哺乳动物存在共生关系，微生物能够通过宿主获得稳定的营养供应，而宿主则受益于微生物对生理的重要贡献。宏基因组学分析推动了人体自然定植的研究，揭示了以前被认为是无菌的身体部位的微生物群，这包括上生殖道和胎盘，挑战了1个世纪以前提出的“无菌子宫”理念。目前，越来越多的研究认为子宫内膜存在细菌定植[10-11]。韩阳等[12]采用高通量测序流产女性子宫内的微生物菌群显示，自然流产女性变形菌门、大肠埃希菌/志贺菌属分别为主要的优势菌门、菌属，分别占92.83%、85.14%。本研究采用高通量测序发现流产组和对照组的变形菌门分布均明显高于正常组，异常球菌-栖热菌门分布均明显低于正常组，对照组的大肠埃希菌/志贺菌属分布明显低于正常组，说明RSA也是以变形菌门、大肠埃希菌/志贺菌属作为主要的优势菌门、菌属。本研究中Kendall′s tau-b分析显示，子宫内膜微生物群的变形菌门与RSA呈正相关，异常球菌-栖热菌门与RSA呈负相关，提示子宫内膜微生物群在RSA发病中可能发挥作用，可为RSA治疗提供辅助参考。

3.3 肠道菌群与RSA相关性

肠道菌群种类和数量庞大，是人体“隐藏的器官”。有研究表明，肠道菌群的紊乱会导致慢性炎症，引发肿瘤的发生及进展[13]。尹玮等[14]和李变玲等[15]研究发现，肠道菌群与肥胖、糖尿病、心脑血管疾病、炎症性肠炎、胃肠道癌症和自身免疫性疾病等具有一定的相关性。为适应肠道微生物群的存在，肠道菌群及其产生的代谢物，可以与宿主的免疫系统进行相互作用，导致肠黏膜表面吞噬细胞的炎症反应能力及自然杀伤(natural killer，NK)细胞的杀伤能力都要低于血循环的正常免疫细胞。RSA患者蜕膜组织局部的免疫功能存在表达异常，其血液为高凝状态，且纤溶系统也受到损伤[16]。妊娠期糖脂代谢的异常，不仅会造成肠道菌群结构及功能的变化，还会造成婴儿肠道菌群早期定植异常，对子代的远期发育造成影响，增加子代成年后发生慢性代谢性疾病的风险。梁惠霞等[17]研究表明，妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)患者的乳杆菌和双歧杆菌的数量相对较少，提示其可能在GDM的发生及发展中发挥作用。本研究发现，三组的酵母菌、肠球菌、肠杆菌含量比较：流产组>对照组>正常组，三组乳的乳杆菌、双歧杆菌含量比较：正常组>对照组>流产组，提示在RSA中，酵母菌、肠球菌、肠杆菌总菌数数量较多，乳杆菌、双歧杆菌总菌数数量较少，与徐广立等[18]的研究吻合。本研究中Spearman分析显示，肠道菌群的酵母菌、肠球菌、肠杆菌与RSA均呈正相关，乳杆菌、双歧杆菌与RSA均呈负相关，提示RSA与肠道菌群密切相关，可能成为后期治疗的靶点。

综上所述，RSA患者子宫内膜生物群偏高，肠道菌群水平均偏高，且与子宫内膜微生物群和肠道菌群均存在相关性，可为RSA的后期治疗提供辅助参考。