清除斑块胆固醇结晶治疗动脉粥样硬化的研究进展

莫芮，陈松，苏志桂*

(1.中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海 200011)

心脑血管疾病是全球导致死亡人数最多的一类疾病，而动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要诱因[1-2]。AS起因复杂，与高血脂、高血压、吸烟和糖尿病等有关[3-4]。研究表明，胆固醇结晶是AS斑块中的重要组成部分，是促进AS病程进展的关键因素，可造成血管内皮功能紊乱，促进炎症反应，加速斑块坏死核心形成以及去稳定化。在AS病程晚期，胆固醇结晶极易诱导斑块破裂，从而造成急性心脑血管事件[5]。因此，清除胆固醇结晶或抑制胆固醇结晶的形成将有利于控制AS病程进展和促进AS归转，对降低AS相关心脑血管疾病的发生具有重要的临床意义。并且，目前临床采用的或在研的治疗AS药物主要为具有降血脂作用的药物来间接控制AS病情的发展，其疗效有限且具有横纹肌溶解、肾衰竭、肝酶异常等药物不良反应[6]。由于AS斑块内胆固醇的蓄积以及胆固醇结晶的形成对AS的进展具有显著促进作用，而直接针对AS斑块内胆固醇逆转运及清除胆固醇结晶的治疗策略目前研究较少，是开发治疗AS新药物的热点方向。为此，本文将综述近年来斑块中胆固醇结晶的形成过程和特点、胆固醇结晶促进AS病程进展机制、清除或抑制斑块胆固醇结晶的策略及治疗AS作用等方面的研究进展，为开发以斑块胆固醇结晶为靶点的抗AS药物提供理论依据和参考。

1 斑块胆固醇结晶的形成

1.1 胞内胆固醇结晶形成 研究表明，在AS早期即可在内皮细胞、巨噬细胞/泡沫细胞胞内发现胆固醇结晶。一般认为，血管内皮细胞激活并增强摄取血液循环中的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)可导致血管内皮细胞产生胆固醇结晶。LDL中的胆固醇以胆固醇酯的形式存在[5]，被血管内皮细胞摄取的LDL可转运至内涵体/溶酶体并发生降解，其中胆固醇酯被降解为游离胆固醇[7]。游离胆固醇借助血管内皮细胞中常见的多囊泡体实现胞内转运[8]。由于激活状态下血管内皮细胞大量摄取LDL，造成ATP结合盒转运子A1蛋白(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)和ATP结合盒转运子G1蛋白(ATP-binding cassette transporter G1，ABCG1)介导的游离胆固醇外排功能缺陷，最终导致游离胆固醇的胞内蓄积，并形成盘状或针状结构的胆固醇结晶[7]。

血管内皮细胞内胆固醇结晶的形成加剧血管内皮功能紊乱，使血管通透性增加，从而有利于LDL渗透过血管内皮而在动脉壁内蓄积。伴随着血管内皮持续受损和炎症反应的加剧，大量的免疫细胞如单核细胞、中性粒细胞等被招募至受损血管局部，并释放活性氧及髓过氧化物等成分，将LDL氧化成为氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)[9-10]。Ox-LDL可被单核细胞分化而成的巨噬细胞识别和吞噬，而巨噬细胞吞噬大量ox-LDL后将转变为泡沫细胞[11]。进入巨噬细胞/泡沫细胞中的ox-LDL在晚期内涵体中降解，其中胆固醇酯被水解为游离胆固醇[12]。目前报道，游离胆固醇在巨噬细胞/泡沫细胞内的转运途径包括：①经循环内涵体途径转移至细胞膜储存；②经晚期内涵体/溶酶体中尼曼-匹克C1型蛋白(Niemann-Pick type C1，NPC1)转运到细胞膜上的ABCA1和ABCG1并主动外排出细胞，经胆固醇逆转运机制输送回肝脏代谢；③经NPC1转运至内质网重新脂化并在脂质微粒中储存；④转移到线粒体中经Cyp27A1酶作用下形成27-羟基胆固醇再通过被动扩散的形式释放到细胞外，经胆固醇逆转运机制输送回肝脏代谢[13-14]。在AS持续病变状态下，由于游离胆固醇的生成量远超过了巨噬细胞或泡沫细胞自身的处置能力，剩余的游离胆固醇随晚期内涵体转运至溶酶体蓄积，形成胆固醇结晶[15-16]。

1.2 胞外胆固醇结晶形成 血管内皮细胞中产生的胆固醇结晶会被分泌到内皮下的基底侧[7]，并且蓄积了大量胆固醇酯和胆固醇结晶的泡沫细胞在死亡后也会将这些脂质释放到胞外区域，从而导致胞外胆固醇结晶增多[5]。此外，从受损血管中渗透至斑块的红细胞细胞膜中的胆固醇，也会导致胞外胆固醇结晶的形成[17]。除上述提到的原因外，伴随AS进展斑块中的高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)逆转运胆固醇功能发生明显障碍，因而不能及时转运细胞分泌的游离胆固醇，也是促进胞外形成胆固醇结晶的关键因素[18]。当斑块局部微环境的物理化学条件满足结晶生长要求时，被分泌到胞外的胆固醇结晶会与血管内皮下的其他脂质晶体以及游离脂质液滴融合进而生长成为大的胆固醇结晶[7]。研究表明，在AS晚期斑块中的胆固醇结晶以胆固醇一水合物结晶为主要晶型[19-20]，胆固醇分子的羟基和水分子间形成二维氢键网络，并呈现厚的菱形结构和薄平的盘状结构[21]。

2 胆固醇结晶促进动脉粥样硬化病程进展

胆固醇结晶伴随AS发生发展的全过程[15，22]。在AS早期，血管内皮细胞释放至基底侧的胆固醇结晶不仅会严重损害血管内皮屏障的完整性，还可诱导炎症反应产生[7，23]，最终促进LDL以及免疫细胞的跨血管内皮迁移并在血管内皮下蓄积，为AS病程进展提供物质基质。此外，Duewell等[15，24]报道斑块中的胆固醇结晶还可作为第二信号分子诱导巨噬细胞产生NOD样受体蛋白3(nod-like receptor related protein，NLRP3)炎症小体，并使caspase-1活化，增加促炎因子白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的分泌[21，25]。IL-1β被认为具有极强的促AS进展作用，与AS的恶化程度呈正相关。进一步研究表明，斑块中的胆固醇结晶能够诱导中性粒细胞释放胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)，而NETs可激活巨噬细胞使其产生IL-1β前体(pro-IL-1β)，从而促进IL-1β的释放[26]。此外，NET形成的同时还会导致中性粒细胞胞内物质的释放，从而改变斑块局部微环境pH值，进一步促进胆固醇结晶生长[27]。斑块大量胆固醇结晶的出现可诱导巨噬细胞/泡沫细胞凋亡和坏死，由于斑块中清除凋亡和坏死细胞的胞葬作用仅为正常水平的1/20[28-29]，因而无法及时清除的凋亡或坏死细胞将加速斑块坏死核心形成[30]。在坏死核心中，胆固醇结晶的生长会导致体积膨胀从而拉伸斑块纤维帽，使纤维帽变薄而促进不稳定斑块形成[5]。临床病理研究表明，以针状结晶形式存在于斑块中的胆固醇结晶更易于刺穿覆盖于斑块表面的纤维帽[31-32]，从而导致斑块破裂和血栓形成，出现急性心脑血管疾病[21,33]。基于胆固醇结晶在AS斑块形成及心脑血管疾病发生发展中所起的关键作用，以胆固醇结晶作为AS治疗的靶点将具有重要的临床意义。

3 清除胆固醇结晶治疗动脉粥样硬化的策略

3.1 增溶策略清除胆固醇结晶

3.1.1 熊去氧胆酸 熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)是一种天然亲水性胆汁酸，具有良好的耐受性且几乎无毒副作用。研究表明，口服给予ApoE-/-小鼠UDCA可以促进胆固醇外排并减少AS斑块中的胆固醇结晶，从而抑制AS病程进展。UDCA介导的AS保护作用的潜在机制一方面是通过增溶胆固醇结晶从而提高胆固醇代谢转化，同时，胞内游离胆固醇的增加可上调ABCA1和ABCG1的表达[34]，促进胆固醇外排。另一方面，UDCA增溶胆固醇结晶后也可以显著抑制由胆固醇结晶诱导的NLRP3炎性小体激活，从而减少IL-1β释放，抑制AS炎症发展[35]。Abendan等[36]对UDCA增溶胆固醇结晶的机制研究发现，UDCA增溶胆固醇结晶与其在水中形成胶束有关，与胆固醇结晶发生作用时，UDCA胶束对胆固醇结晶的溶解从最顶层开始并逐层溶解。

3.1.2 β-环糊精及其衍生物 环糊精是一系列环状低聚糖的总称，目前最常用的环糊精是由7个葡萄糖分子组成的β-环糊精(β-cyclodextrin，β-CD)[37]。β-CD具有外周亲水和内腔疏水的特征，因此在水性介质中β-CD与疏水性分子可通过主-客体相互作用实现对疏水性分子的增溶[38]。β-CD通过这种增溶作用可以从细胞膜中提取胆固醇，当β-CD浓度足够高时会导致红细胞发生溶血[37]。为了增加水溶性以及降低β-CD的溶血副作用，目前已有多种β-CD衍生物被开发出来，其中羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)和磺丁基-β-环糊精(sulfobutyl ether-β-cyclodextrin，SBE-β-CD)已被FDA批准用于注射给药。

最近研究表明，皮下注射给予载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠HP-β-CD可显著缩小AS斑块处的胆固醇结晶面积，从而有效抑制AS的发生发展。HP-β-CD发挥抗AS作用的机制研究表明，HP-β-CD可与胆固醇结晶表面的胆固醇分子发生主-客体相互作用，形成水溶性包合物，从而把胆固醇分子从晶格中萃取出来。HP-β-CD增溶的胆固醇可经乙酰辅酶A(acetyl-coenzyme A，CoA)乙酰转移酶催化后转化为胆固醇酯，储存于脂质滴中，从而防止胆固醇向结晶态的相转变[39]。此外，HP-β-CD增溶的胆固醇也可以转运至线粒体中被Cyp27A1氧化成水溶性的27-羟基胆固醇，并通过自由扩散的方式跨越细胞膜进行转运。同时，27-羟基胆固醇具有调节肝脏X受体(liver X receptor，LXR)转录活性的功能，从而调控Abca1和Abcg1基因，促进胆固醇外排及逆转运[2，40]。并且，HP-β-CD增溶的胆固醇也可以直接被机体经尿或粪便排泄出体外[39]。已有研究报道，大剂量口服给予HP-β-CD已用于治疗因NPC-1基因缺陷而导致的脂质在肝、脾及脑部沉积所引起的尼曼-匹克C型病[41]，但是HP-β-CD是否可以用于临床治疗AS仍有待进一步的研究。

3.2 抑制胆固醇结晶形成策略

3.2.1 他汀类药物 他汀类药物通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，来减缓胆固醇的产生，并能够促进受体介导LDL从血浆中移除，发挥降血脂抗AS作用[42]。近年来的研究表明，他汀类药物除了降血脂功能外，还可通过抑制斑块炎症、促进斑块局部胞葬作用和抑制斑块胆固醇结晶形成而发挥治疗AS作用[43-44]。他汀类药物抑制斑块胆固醇结晶形成有两种机制，一方面他汀类药物可直接抑制胆固醇结晶生长，如阿托伐他汀的代谢物可以通过抗氧化机制抑制细胞膜上胆固醇结晶的形成[45]。另一方面，他汀类药物还能够改变胆固醇的结晶方式，从而降低胆固醇结晶时的体积膨胀峰值，并且将胆固醇结晶由尖锐的、菱形的晶体形态转变为钝化的、破碎的晶体形态。上述作用的发挥主要是因为他汀类药物能够通过与胆固醇分子发生疏水相互作用，从而干扰胆固醇结晶的晶格形成。此外，体外研究还显示，辛伐他汀、阿托伐他汀和普伐他汀可以显著溶解人离体冠状动脉、颈动脉和股动脉斑块中的胆固醇结晶，且他汀类药物溶解胆固醇结晶的机制类似于乙醇溶解结晶的作用过程[44]。

3.2.2 环磷酸腺苷增强剂 环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是一种“屏障稳定剂”，可以降低血管内皮渗透性[46]。毛喉素(Forskolin)和咯利普兰(Rolipram)是cAMP增强剂。Forskolin通过直接结合和激活腺苷酸环化酶亚型来增加cAMP的合成[47]。Rolipram通过抑制磷酸二酯酶PDE4家族来抑制cAMP的降解[48]。Baumer等[7]发现联合给予Forskolin和Rolipram能够抑制血管内皮细胞中胆固醇结晶形成和降低胆固醇酯的含量[]。体内研究表明，在AS早期，Forskolin和Rolipram能够显著抑制主动脉窦斑块中的胆固醇结晶生成，从而恢复血管内皮健康状态。然而，尽管Forskolin和Rolipram具有增强血管内皮屏障的作用，但二者减少斑块胆固醇结晶的机制还有待研究[49-50]。

3.3 纳米药物递送系统清除胆固醇结晶 基于纳米药物递送系统高载药量、高稳定性、可控药物释放及AS斑块特异靶向的功能特点，目前纳米药物递送系统已被广泛应用于AS靶向治疗研究。针对斑块中富含胆固醇结晶的特点，Li等[51]将β-CD修饰在超顺磁铁纳米粒表面，旨在利用β-CD与胆固醇结晶间的亲和力实现靶向检测AS中胆固醇结晶的目的。为了清除泡沫细胞中的胆固醇，Ravishankar等[52]利用铜催化点击反应将铁蛋白和β-CD连接起来获得铁蛋白纳米笼，在铁离子存在下铁蛋白纳米笼可自组装形成纳米聚集体。研究表明，该纳米聚集体利用铁蛋白和泡沫细胞表面的转铁蛋白受体相互作用可有效递送至泡沫细胞内，并通过β-CD和细胞内胆固醇分子间的主-客体作用实现增溶胆固醇，最终显著降低泡沫细胞内的胆固醇含量，显示出抗AS潜力。AS斑块中富含胆固醇和巨噬细胞，二者均为引发炎症的关键因素。为此，Kim等[53]利用甲基β-CD与辛伐他汀之间的主-客体作用制得辛伐他汀/甲基β-CD包合物，并以磷脂为外壳将上述包合物作为内核构建纳米复合物(CSNP)。研究表明，CSNP可利用斑块局部血管内皮渗透性增加的特点靶向富集于AS斑块，同时由于斑块内胆固醇分子与甲基β-CD的亲和力要远高于辛伐他汀与甲基β-CD的亲和力，因此胆固醇分子将辛伐他汀从甲基β-CD的空腔中置换下来，实现释放辛伐他汀和增溶胆固醇分子的目的，最终显示出减少AS斑块面积，降低斑块内胆固醇和巨噬细胞含量的作用结果。尽管上述的研究中均无纳米药物递送系统直接清除胆固醇结晶的相关内容，但是斑块内实现直接递送β-CD意味着可发挥增溶胆固醇结晶的功能，因而可推测具有清除斑块内胆固醇结晶的作用。

4 总结

综上所述，动脉粥样硬化是心脑血管疾病的关键诱因，而胆固醇结晶对动脉粥样硬化的发生发展具有显著的促进作用。合理的清除斑块内胆固醇结晶或抑制胆固醇结晶的形成均有利于抑制动脉粥样硬化病程进展。尽管已有研究表明，利用增溶胆固醇结晶策略、抑制胆固醇结晶生长策略以及纳米药物递送系统等均在一定程度上减少斑块中的胆固醇结晶或胆固醇含量，但是仍需要进行深入的研究以阐明体内增溶胆固醇结晶或抑制胆固醇结晶生长的作用过程及机制、机体处置游离胆固醇的过程和机制。并且，针对上述的清除胆固醇结晶策略还需开展体内安全性的研究，从而为基于胆固醇结晶为靶点的抗动脉粥样硬化新药的发现提供充分理论依据和参考。