氨基酸代谢调控与肿瘤免疫研究进展

陈星伊，王旭，周陶，杨勇

(中国药科大学药物科学研究院，江苏 南京 211198)

自“Warburg效应”被提出后[1]，肿瘤代谢研究的加速持续改变着研究者对肿瘤学的理解和认知，多个最新的研究揭示了氨基酸在肿瘤代谢中的重要作用。氨基酸具有氧化还原平衡、能量调节、生物合成支持和维持内稳态的基本功能，其广泛的功能使得氨基酸代谢在肿瘤研究中倍受欢迎。在肿瘤发展过程中，由于其异常增殖，肿瘤细胞需要大量营养物质来维持生长所需，同时还需要逃避来自宿主免疫系统的监视和攻击，这些过程肿瘤细胞都是以独特的代谢方式实现的。T细胞与肿瘤细胞经历相似的代谢重编程，激活的T细胞同样依赖于持续的营养供应，以确保其正确分化和正常功能维持[2]。本综述主要讨论了氨基酸代谢在肿瘤微环境中的重要性及对肿瘤免疫的影响，并论述其未来成为肿瘤免疫治疗方向的潜力。

1 肿瘤微环境中的精氨酸代谢和色氨酸代谢

1.1 精氨酸代谢与抗肿瘤免疫 精氨酸(arginine，Arg)具有重要的营养和生理意义，是蛋白质/尿素/肌酸/谷氨酸/一氧化氮和胍丁胺等信号分子的重要前体物质。精氨琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthase,ASS1)和精氨琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ASL)将瓜氨酸催化合成精氨酸，精氨酸由精氨酸酶1(arginase，ARG1)分解为鸟氨酸和尿素，鸟氨酸通过精氨酸酶(arginase，ARG)和鸟氨酸转氨甲酰酶(ornithine transcarbamylase,OTC)转化为瓜氨酸，并使其能在线粒体中再循环。

精氨酸虽然是一种非必需氨基酸，但在特定生理条件或疾病状态下非常重要[3]。精氨酸缺乏导致T细胞的蛋白质生物合成介导的细胞耗尽，从而导致T细胞失去其抗肿瘤活性[4]。精氨酸激活基因表达程序，增强T细胞的生物能量，导致像T细胞状态的中央记忆和提高抗肿瘤活性[5]。许多肿瘤生长依赖外源性精氨酸，因为它们缺乏ASS1表达[6]。Kobayashi等[7]发现骨肉瘤患者ASS1缺乏会导致肿瘤肺转移，通常与侵袭性表型有关，患者预后较差。这种ASS1缺乏导致肿瘤侵袭性变强的现象，可以通过肿瘤需要更有效地利用肿瘤微环境中的外源性精氨酸来解释。哺乳动物中ARG包括ARG1和ARG2两种，在许多肿瘤中，例如乳腺癌，胃癌，前列腺癌，神经母细胞瘤，肿瘤微环境中的整体ARG活性增强[8]。ARG1活性增强会导致肿瘤相关髓细胞(tumor associated myeloid cells,TAMCs)的扩增，TAMCs因响应肿瘤衍生物因子和代谢物，包括白介素4(interleukin，IL-4)、IL-13、IL-6、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)、乳酸和环状单磷酸腺苷等，以及低氧诱导因子1α(HIF-1α)相关的分子通路，从而反馈性上调ARG1[9]。ARG1水解精氨酸得到的产物为肿瘤细胞提供了多胺合成前体，促进肿瘤生长并降低了免疫细胞对精氨酸的利用率[10]。TAMCs还会触发一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)将精氨酸氧化生成NO，NO可以抑制主要组织相容性复合体-Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ,MHC-Ⅱ)表达，从而抑制T细胞的增殖，并促进T细胞凋亡，抑制T细胞功能[11]。因肿瘤微环境中高水平的ARG1导致的低浓度精氨酸还会促进NOS解偶联并产生超氧阴离子(O2-)，NO与O2-在病理条件下会结合并产生各种活性氮(reactive nitrogen species，RNS)，它会破坏微环境中T细胞活性[12]。综上所述，TAMCs在肿瘤微环境中能够靶向精氨酸代谢，帮助肿瘤逃避免疫攻击，从而抑制抗肿瘤免疫反应。

虽然针对精氨酸代谢的免疫治疗在仍处于起步阶段，体外和体内的精氨酸代谢研究使得精氨酸剥夺疗法发展迅速。目前靶向精氨酸代谢的药物有ADI-PEG20[13]，和人精氨酸酶(rhArg1-PEG)，前者已在肿瘤治疗中展现出了治疗潜力[14]。

1.2 肿瘤微环境中的色氨酸 色氨酸(tryptophan，Trp)是另一种与免疫耐受调节和抗肿瘤免疫反应有关的氨基酸。它的分解代谢包括两步。吲哚胺2,3-双加氧酶-1(indoleamine 2,3-dioxygenase-1，IDO1)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase，TDO)催化L-色氨酸分解代谢的第一步，沿着犬尿氨酸途径，产生一系列分子，统称为犬尿氨酸(kynurenine,Kyns)。已有研究表明，IDO在多种肿瘤中过表达[15-16]。IDO包括IDO1和IDO2两种亚型，IDO2近年才被克隆出来[17]。所以一直以来针对IDO1的研究更为广泛。

IDO由免疫细胞和肿瘤细胞共同表达。正常情况下，由于色氨酸易穿过质膜，表达IDO的树突细胞(dendritic cell，DC)会消耗胞外色氨酸，限制色氨酸对周边T细胞的供应，从而阻碍T细胞的活化及增殖[10]，这在自身免疫和抗炎反应中发挥重要作用；有研究报道IDO+的DCs可以抑制同种异体抑制排斥反应，延长小肠移植小鼠的存活时间[18]。IDO抑制剂处理的ApoE-/-小鼠血管炎症增强[19]。而在肿瘤微环境中，IDO限制了T细胞对肿瘤细胞的响应，Uyttenhove等[20]通过小鼠肥大瘤细胞P815模型证明，注射IDO阴性P815细胞的小鼠多数不会发生肿瘤，IDO阳性P815组的小鼠则发展出肿瘤并最终死亡。子宫内膜癌组织免疫组织化学染色结果也表明，高IDO水平与低水平CD3+、CD8+和CD57+免疫细胞存在显著相关性。这些都表明，肿瘤微环境中的效应T细胞比肿瘤细胞更易受到IDO的影响[10]。

在肿瘤微环境中，由IDO导致的低浓度色氨酸具有抑制mTOR(mammalian target of rapamycin)激酶途径和激活GCN2(general control nonderepressible 2)激酶途径的双重作用[21]。GCN2会影响IDO+细胞和其邻近T细胞的基因表达[22-23]。色氨酸剥夺还会下调T细胞受体复合物ζ链和c-Myc的表达水平，从而抑制T细胞的增殖[24]。除了这种直接的T细胞抑制方式，IDO还可以通过激活调节性T细胞(T regulatory cell，Treg)产生有效的间接免疫抑制。暴露于IDO的幼稚型CD4+T细胞倾向于成为Foxp3+诱导的Tregs[25]。IDO还可以直接激活成熟的、预先存在的Tregs，显著增强抑制功能[26]。IDO和TDO产生的Kyns是芳烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)的内源性激动剂，AhR是T细胞和DCs中一种配体激活的转录因子。Kyns诱导的AhR激活促进效应T淋巴细胞转化为Tregs，并上调DCs中IDO1的表达，从而进一步增强免疫调节作用并阻断抗肿瘤免疫[27]。

目前，IDO抑制剂已广泛应用于临床前和临床试验。目前靶向色氨酸的药物包括：IDO抑制剂D1-甲基-色氨酸(D-1-methyl-tryptophan,D-1MT)和TDO抑制剂(E)-6-氟-3[2-(1H-四唑-5-基)乙烯基]-1H-吲哚(LM10)。此外还有联合用药靶向IDO的治疗方法[28]。

1.3 TGF-β、精氨酸与色氨酸——免疫抑制三联体 如前所述，IDO由DCs和肿瘤细胞共表达。在人体中，ARG1主要表达于肝脏、红细胞和中性粒细胞三级颗粒中，其在细胞外释放后具有酶活性[29]。在小鼠中，ARG1也存在于其他免疫细胞中，如小鼠巨噬细胞和DCs[30]。尽管ARG1和IDO1在髓细胞中的主要诱导物不同，分别是IL-4和IFN-γ，此外TGF-β也可以影响二者的活性。TGF-β在DCs中同时诱导ARG1和IDO1，而ARG1上调速度比IDO1快。ARG1的代谢产物L-鸟氨酸是鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)产生多胺的底物，多胺在肿瘤中可通过激活MAPK和Src激酶促进酶的磷酸化和下游信号转导来促进肿瘤细胞增殖。故ARG1升高导致的L-鸟氨酸水平升高有利于IDO磷酸化及长期的免疫调节信号的激活[8]。由此可见TGF-β与ARG1和IDO1建立的免疫抑制网络在肿瘤免疫方面非常重要，同时抑制ARG1和IDO1活性或TGF-β信号传导可能是肿瘤免疫治疗的潜在靶点。

2 谷氨酰胺代谢与肿瘤的免疫逃逸

谷氨酰胺(glutamine，Gln)是肿瘤细胞消耗最多的氨基酸[31]。谷氨酰胺是一种非必需氨基酸，但增殖细胞对谷氨酰胺具有成瘾性，这表明谷氨酰胺是增殖细胞的条件必需氨基酸。谷氨酰胺可以用于核苷酸和脂质生物合成，也可以用于合成谷氨酸，谷氨酸可以转化为α-酮戊二酸的中间代谢物，将谷胱甘肽还原为还原形式，抑制氧化应激，并维持线粒体膜完整性，从而有助于增殖细胞的存活。有研究表明谷氨酰胺分解代谢在肿瘤细胞中是增加的[32]。

Fu等[33]评估了细胞外谷氨酰胺耗竭对免疫微环境的影响。高谷氨酰胺水平肿瘤的CD8+T细胞中的干扰素γ(interferon-γ，IFNγ)、人颗粒酶B(human granzyme B，GZMB)、穿孔蛋白(perforin，PRF1)表达较低。使用敲低膜定位的谷氨酰胺转运蛋白溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5，SLC1A5)或者谷氨酰胺转化为谷氨酰胺的限速酶谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)的肾癌细胞建立小鼠肾癌模型，发现肿瘤细胞内谷氨酰胺，谷氨酸和α-酮戊二酸的浓度降低，表明肿瘤细胞中的谷氨酰胺分解减少。同时，SLC1A5和GLS的敲低都增强了肿瘤浸润性CD8+T细胞的增殖能力和细胞毒性；这些结果证实肿瘤细胞固有的谷氨酰胺代谢抑制了肿瘤微环境中的细胞毒性T细胞反应。而产生这种细胞毒性抑制的机制是高谷氨酰胺代谢的肿瘤细胞具有更高水平的Treg，GLS和SLC1A5的下调使谷氨酰胺减少，导致Treg增殖减少及活性下降。

T淋巴细胞需要中性氨基酸转运蛋白2(sodium-coupled neutral amino acid transporter2，SNAT2)摄取谷氨酰胺，SNAT2缺乏则T淋巴细胞无法分化为辅助性T淋巴细胞1(T helper 1,Th1)和辅助性T淋巴细胞17(T helper 17,Th17)[34]。当缺乏谷氨酰胺时,有利于T淋巴细胞向Th1细胞分化的微环境不能使CD4+T分化为Th1细胞，而是分化为Foxp3+Treg细胞。加入α-酮戊二酸或使用特异性转录因子T-bet进行诱导，则可逆转这一现象[35]。

6-重氮5-氧代-1-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-l-norleucine，DON)是一种谷氨酰胺拮抗剂，能够全面抑制谷氨酰胺代谢，之前已在多种肿瘤类型中开展临床试验评估其有效性，但由于其严重的药物毒性而被放弃[36]。Robert等[37]设计了一系列包括JHU083在内DON的前药小分子来探究肿瘤中谷氨酰胺代谢是否可以成为免疫检查点。通过13C-葡萄糖示踪技术，他们发现阻断谷氨酰胺代谢后葡萄糖代谢受到抑制，同时可以改善肿瘤微环境缺氧的状况。这表明阻断谷氨酰胺代谢可以严重破坏肿瘤细胞的整体代谢，并对肿瘤微环境内的营养环境产生显著影响。在采用过继性T细胞疗法(adoptive T-cell therapy,ACT)之前使用JHU083对B16黑色素瘤(B16OVA)小鼠进行代谢治疗，处理过的小鼠显示出肿瘤控制和存活率的改善，这表明谷氨酰胺阻断可以调节肿瘤微环境以增强T细胞疗法的疗效。对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)进行检测后发现，在JHU083处理的小鼠中CD8+TILs对肿瘤内细胞死亡的敏感性较低，之前有研究猜想，CD8+T细胞功能障碍和肿瘤免疫逃逸的机制是肿瘤微环境中肿瘤特异性T细胞的凋亡[38]，上述结果与此猜想一致。以上研究结果表明阻断谷氨酰胺可以诱导不同的代谢程序从而改善肿瘤的免疫逃逸，谷氨酰胺代谢是肿瘤免疫治疗的一个潜在靶点。

3 新兴氨基酸代谢与肿瘤免疫的研究

3.1 半胱氨酸——T细胞增殖的必需氨基酸 哺乳动物细胞可以合成蛋白质需要半胱氨酸(cysteine，Cys)，大多数细胞可通过半胱氨酸酶将胞内蛋氨酸转化为半胱氨酸，或者通过半胱氨酸转运体Xc-将胞外的胱氨酸运输进细胞，再将胱氨酸还原为半胱氨酸。由于T细胞缺乏半胱氨酸酶，其Xc-转运体缺乏XCT链，T细胞只能依赖于其他细胞产生的半胱氨酸。半胱氨酸由巨噬细胞和DCs等抗原递呈细胞(antigen-presenting cells，APCs)APCs提供，由T细胞的质膜ASC中性氨基酸转运体运输至胞内，并参与T细胞完成抗原递呈和活化的过程。有研究表明，由于MDSCs表达Xc-转运体，但不表达ASC中性氨基酸转运体，因此它们能够从环境中获得胱氨酸，但不能输出半胱氨酸，通过限制细胞外半胱氨酸，肿瘤特异性T细胞不被激活，因此抗肿瘤免疫被抑制[39-40]。然而仍需更多研究进一步阐明胱氨酸缺乏在免疫抑制中的作用。

3.2 苯丙氨酸代谢引起的免疫抑制 苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)代谢也可参与免疫应答。白细胞介素4诱导基因1(interleukin four induced gene1，IL-4I1)最早是在小鼠中发现的，后期在人类B细胞中也被鉴定出来。它是一种分泌型l-苯丙氨酸氧化酶，通过苯丙氨酸的氧化脱氨作用产生过氧化氢(H2O2)和苯丙酮酸。目前，B细胞中唯一已知可诱导IL-4I1的细胞因子是IL-4；IL-4通过刺激IL-4/IL-13受体进而使转录因子STAT6磷酸化而发挥作用[41]。人、小鼠IL-4I1可通过APCs和小鼠MDSCs表达，IL-4I1在各种类型肿瘤中的巨噬细胞中都能被检测到[42]。有研究表明，IL-4I1在肿瘤诱导的小鼠MDSCs中的mRNA表达增加，表明IL-4I1可能参与选择性激活异源髓细胞对T细胞活化的负反馈调节过程[41]。Boulland等[43]还提出IL-4I1可通过H2O2的产生，抑制CD3ζ链的表达和T细胞的增殖，从而作为免疫调节因子。这些研究表明，IL-4I1和苯丙氨酸代谢可能是MDSCs的重要抑制机制。

3.3 亮氨酸通过mTOR通路对肿瘤免疫的影响 支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)包括亮氨酸(leucine，Leu)，异亮氨酸和缬氨酸，约占健康个体必需氨基酸的40%。其中，亮氨酸不仅是生物合成必需的组分之一，还是调节mTOR途径的信号[44]，是公认的mTOR信号激活剂[45]。mTOR通路在许多类型的肿瘤中均被上调，并且以mTOR为靶点的肿瘤治疗已成为临床研究的一部分[46]。免疫细胞对mTOR的调节特别敏感，因为mTOR途径会影响免疫细胞的分化和功能，在没有mTOR信号的情况下，CD4+T细胞则无法分化为效应细胞。抑制T细胞中的mTOR通路会促进T细胞耐受，而维持耐受的机制之一是当亮氨酸抑制剂存在，T细胞无法上调mTOR活性[47]。由此可见，亮氨酸作为一种重要的调节信号，通过mTOR通路对免疫细胞的增殖和活化都产生着一定的影响，但mTOR信号通路与肿瘤微环境中亮氨酸代谢的直接联系仍需进一步探索。

4 结语

近年来的研究已经证明了氨基酸在肿瘤代谢中的重要作用，氨基酸为肿瘤细胞提供营养并参与肿瘤免疫调控，但靶向氨基酸的抗肿瘤药物研发仍面临诸多挑战。首先由于氨基酸代谢的灵活性、复杂性以及肿瘤研究模型的局限性，离体和在体模型之间转换时,代谢表型会发生改变。其次，肿瘤细胞和免疫细胞对氨基酸及氨基酸代谢酶有着相似需求，并经常在微环境中竞争相同的氨基酸，所以需要明确肿瘤细胞特有的代谢通路而尽可能减少对机体的毒性反应。另外，氨基酸代谢表型会因为肿瘤类型的不同而存在差异。目前，体外针对氨基酸代谢的靶向小分子抑制剂研究已经取得了很大的进展[10]，但在体内实现肿瘤干预仍面临诸多问题，因此，必须谨慎地探索肿瘤微环境中的治疗性干预措施，以消除对抗肿瘤免疫力的潜在负面影响。由于大多数代谢抑制剂无法作为单一有效的治疗药物，因此联合治疗可能是较为合理的策略，如PD-1免疫检查点抑制剂派姆单抗(pembrolizumab)与IDO1抑制剂联用[48]。相信对氨基酸代谢与肿瘤免疫机制了解的深入，可以为调节肿瘤微环境，增强抗肿瘤免疫反应提供新的思路。