骨康胶囊对大鼠肝脏药物转运体蛋白表达的影响

李 靖， 贺亚都， 王爱民， 李勇军， 郑 林， 刘 亭*

(1.贵州医科大学，贵州省药物制剂重点实验室/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004；4.铜仁市万山区人民医院，贵州 铜仁 554200；5.贵州维康子帆药业股份有限公司，贵州 修文 550200)

在肝脏表面广泛分布着高表达的摄取型和外排型转运体[1-2]。摄取型转运体主要包括有机阴离子转运多肽(organic anion-transporting polypeptide，OATP)、有机阴离子转运体(organic anion transporter，OAT)、有机阳离子转运体(organic cation transporter，OCT)等，外排型转运体主要包括乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated proteins，MRPs)等[3-5]。越来越多的研究表明，肝脏转运体的活性或表达量决定着药物的代谢命运，直接影响到药物的摄入和清除[6]。因此，研究药物对肝脏转运体的活性或表达，对于阐明药物间的相互作用，指导临床用药具有重要意义。骨康胶囊是贵州传统苗药复方制剂，主要由补骨脂、三七、续断、芭蕉根和酢浆草组成，具有滋补肝肾、强筋壮骨、通络止痛等功效[7-8]，常与其他药物联用于骨性关节炎、骨折、骨质疏松症的治疗[9-11]。目前尚无关于骨康胶囊影响药物转运体活性或表达的报道。为更好地指导骨康胶囊临床应用，本实验从蛋白表达的角度，研究骨康胶囊对大鼠肝脏药物转运体有机阳离子转运体1(organic cation transporter 1，OCT1)、有机阴离子转运多肽1B1(organic anion-transporting polypeptide 1B1，OATP1B1)、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表达的影响，期望为避免骨康胶囊潜在的药物相互作用提供参考。

1 材料

1.1 动物 24只健康雄性SD大鼠，体质量200～250 g，购自长沙天勤生物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK(湘)2014-0011。研究经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准(批准号1503017)。

1.2 试剂与药物 骨康胶囊(贵州维康子帆药业股份有限公司，批号20180521)。超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号103018190830)；膜蛋白提取试剂盒(美国赛默飞公司，批号UC279290)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，批号20190215)；OCT1抗体(批号GR3239193-1)、OATP1B1抗体(批号GR3191515-16)、MRP1抗体(批号GR3219564-3)、MRP2抗体(批号GR3269764-1)、BCRP/ABCG2抗体(批号GR3229567-3)、P-gp抗体(批号GR3219236-1)(英国Abcam公司)；GAPDH抗体(批号TH270579)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(批号TB260069)、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(批号TC262979)(美国Invitrogen公司)。

1.3 仪器 PowerPacTMBasic电泳仪、Trans-Blot® TurboTMSystem蛋白快速转印仪(美国Bio-Rad公司)；GBOX-Chemi-XL1.4凝胶成像系统(英国Syngene公司)。

2 方法

2.1 分组与给药 将24只大鼠随机分为4组，即空白组，骨康胶囊低、中、高剂量组，每组6只，空白组灌胃给予灭菌蒸馏水7 d，每天2次，骨康胶囊用灭菌蒸馏水配成混悬液后灌胃给药，低、中、高剂量分别为0.43、0.86、1.72 g/(kg·d-1)，连续7 d，每天2次。

2.2 大鼠肝脏药物转运体蛋白表达检测 各组大鼠给药7 d后禁食12 h，自由饮水，股动脉放血处死，取肝脏，生理盐水灌洗，置于-80 ℃冰箱中保存备用，膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，置于-80 ℃冰箱中保存备用。取10 μg蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离，使用半干转系统，在25 V、1.0 A条件下转膜30 min，使用5%BSA在4 ℃下封闭12 h，加入GAPDH抗体(1∶5 000)、OCT1抗体(1∶1 000)、OATP1B1抗体(1∶5 000)、MRP1抗体(1∶500)、MRP2抗体(1∶1 000)、BCRP抗体(1∶1 000)、P-gp抗体(1∶1 000)，在4 ℃下孵育10 h，1×TBST洗膜5次，加入相应的二抗(1∶2 000)，于室温下孵育1.5 h，1×TBST洗膜5次，加入化学发光显影液显影，使用Quantity one软件进行条带灰度值分析，计算目的蛋白/内参蛋白灰度值。

3 结果

3.1 骨康胶囊对大鼠肝脏OCT1、OATP1B1蛋白表达的影响 骨康胶囊低、中剂量组大鼠OCT1蛋白表达较空白组升高(P<0.01)，高剂量组无明显变化(P>0.05)，各剂量组大鼠OATP1B1蛋白表达均较空白组降低(P<0.01)，并呈剂量依赖性，见图1、表1。

表1 骨康胶囊对大鼠肝脏OCT1、OATP1B1蛋白表达的影响

注：A为空白组，B为骨康胶囊低剂量组，C为骨康胶囊中剂量组，D为骨康胶囊高剂量组。

3.2 骨康胶囊对大鼠肝脏MRP1、MRP2蛋白表达的影响 骨康胶囊低剂量组大鼠MRP1蛋白表达较空白组降低(P<0.05)，中、高剂量组升高(P<0.05，P<0.01)，低、高剂量组大鼠MRP2蛋白表达与空白组比较无明显变化(P>0.05)，中剂量组升高(P<0.01)，见图2、表2。

注：A为空白组，B为骨康胶囊低剂量组，C为骨康胶囊中剂量组，D为骨康胶囊高剂量组。

表2 骨康胶囊对大鼠肝脏MRP1、MRP2蛋白表达的影响

3.3 骨康胶囊对大鼠肝脏BCRP、P-gp蛋白表达的影响 骨康胶囊各剂量组大鼠BCRP、P-gp蛋白表达均较空白组降低(P<0.01)，见图3、表3。

注：A为空白组，B为骨康胶囊低剂量组，C为骨康胶囊中剂量组，D为骨康胶囊高剂量组。

表3 骨康胶囊对大鼠肝脏BCRP、P-gp蛋白表达的影响

4 讨论

肝脏药物转运体参与药物的吸收、分布、代谢、排泄，其活性的变化可引起生理疾病及药物相互作用[12]，影响临床用药的安全性和有效性[13]。例如，OCT1介导了许多内源性物质和药物从血液进入肝脏进行生物转化[14]。利福平可增加OCT1表达，二甲双胍与其联用后可增强二甲双胍的降血糖作用[15]。OATP1B1参与肝脏从血液中摄取、清除外源性物质，参与非结合型胆红素及许多临床药物的转运，如利福平、氟伐他汀、甲氨蝶呤等[16-17]。MRP1、MRP2、P-gp和BCRP可以将内源或者外源物泵出胞外[16,18-22]。研究表明多柔比星与MRP1的表达抑制剂联用后，可增强其抗结肠癌疗效[23]。川芎的活性成分四甲基吡嗪以及黄连解毒汤等中药制剂均可通过调节MRP2的表达而起到利胆、改善胆汁淤积病症的作用[24]。β-淀粉样蛋白以P-gp为跨膜载体，通过血脑屏障进入血液中[25]。BCRP可介导化疗耐药、内分泌治疗耐药、分子靶向药物的耐药等，转运盐酸米托蒽醌、柔红霉素、阿霉素、拓扑西康、依立替康等抗肿瘤药物[26-27]。

Western blot结果表明，不同剂量骨康胶囊对大鼠肝脏药物转运体的影响不同。高剂量骨康胶囊不影响大鼠OCT1蛋白表达，低、中剂量骨康胶囊升高大鼠OCT1蛋白表达，从而增加机体对OCT1底物的吸收；低、中、高剂量骨康胶囊均抑制大鼠OATP1B1蛋白表达，可能会降低机体对OATP1B1底物的吸收；不同剂量骨康胶囊对MRP1的影响有所差异：低剂量骨康胶囊抑制大鼠MRP1蛋白表达，中、高剂量骨康胶囊升高大鼠MRP1蛋白表达；低、高剂量骨康胶囊不影响大鼠MRP2蛋白表达，中剂量骨康胶囊升高大鼠MRP2蛋白表达；低、中、高剂量骨康胶囊均抑制大鼠BCRP、P-gp蛋白表达，可能会减少联用药物的外排，增加其生物利用度。

综上所述，骨康胶囊可剂量依赖性地改变大鼠肝脏药物转运体OATP1B1蛋白表达，非剂量依赖性地改变大鼠肝脏药物转运体OCT1、MRP1、MRP2、BCRP和P-gp蛋白表达。这一结果提示当骨康胶囊与相关药物尤其是一些治疗窗较窄的药物联合使用时，可能会发生转运体介导的药物相互作用，影响药物的吸收、分布等。与药物转运体OATP1B1相关药物联合使用时，可通过给药剂量预测由转运体介导的药物相互作用，但与药物转运体OCT1、MRP1、MRP2、BCRP和P-gp相关药物联合使用，较难通过给药剂量预测由转运体介导的药物相互作用。当然，由于动物和人在转运体表达调控上的差异，该结论需要进一步临床研究来确证。