红花黄色素对高糖诱导小鼠足细胞损伤的影响及其机制

章 涵， 赵玉霞， 杨惠然， 董 雪

(信阳职业技术学院，河南 信阳 464000)

糖尿病肾病是临床常见疾病类型，随着病情发展可降低患者肾功能。蛋白滤过的最后屏障是足细胞，若其发生损伤可导致肾功能异常，进而促进糖尿病肾病的发生，故减轻其损伤成为治疗糖尿病肾病的重要方法。研究表明，高血糖可引发氧化应激，从而加重肾损伤，最终促进糖尿病肾病发生[1-3]。红花CarthamustinctoriusL.属于菊科植物，其主要活性成分为红花黄色素，具有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤等作用，并可保护心血管、神经系统[4]，但尚无关于该成分对足细胞损伤的作用。

长链非编码RNA FGD5反义RNA 1(lncRNA FGD5-AS1)在牙周炎中表达下调，并可能通过调控miR-142-3p/细胞因子信号抑制分子6(SOCS6)分子轴从而减缓牙周炎的发展[5]。生物信息学分析显示，微小RNA-302a-3p(miR-302a-3p)可能是FGD5-AS1的靶基因，在高糖诱导的肾小管上皮细胞中表达上调，并可能参与糖尿病肾病的上皮-间质转化过程[6]。但红花黄色素是否通过调控FGD5-AS1/miR-302a-3p通路而影响足细胞损伤尚不明确，故本实验探讨该成分对高糖诱导小鼠足细胞损伤的影响，分析其机制是否与调控FGD5-AS1/miR-302a-3p通路相关，以期为糖尿病肾病防治提供新方向。

1 材料

1.1 细胞 小鼠足细胞MPC5，购自美国ATCC公司。

1.2 试剂与药物 红花黄色素(批号180120)购自山东丰泰生物科技有限公司，采用无菌生理盐水溶解红花黄色素，制成质量浓度为30 mg/mL的母液，置于4 ℃冰箱中保存。葡萄糖(批号G8270)、甘露醇(批号PHR1007)购自美国Sigma公司;乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-302a-3p寡核苷酸模拟物(miR-302a-3p mimics)及mimic 阴性对照序列(miR-NC)、FGD5-AS1小分子干扰RNA(si-FGD5-AS1)购自广州锐博生物科技有限公司；Trizol试剂(批号20181003)购自上海联迈生物工程有限公司；反转录(批号4387391)与荧光定量检测试剂盒(批号4385612)购自美国Thermo Fisher公司；MTT(批号20181102)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；细胞凋亡检测试剂盒(批号20171216)购自苏州宇恒生物科技有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(批号A21020)购自武汉艾美捷科技有限公司；兔抗鼠活化的半胱氨酸蛋白酶12(cleaved caspase-12)(批号2202)、脱氧核糖核酸修复酶降解产物(cleaved-PARP)抗体(批号5625)、兔抗鼠C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)(批号5554)、磷酸化真核细胞起始因子(p-eIF2α)(批号9721)购自美国CST公司；葡萄糖调节蛋白78(GRP78)抗体(批号sc-13539)购自美国Santa Cruz公司。

1.3 仪器 Multiskan Sky 酶标仪购自美国Thermo Fisher公司；FACS Calibur流式细胞仪购自北京艾格斯生物科技有限公司；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

2 方法

2.1 分组 MPC5细胞接种于6孔板(每孔3×104个)，分为对照组(含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基孵育48 h)、甘露醇组(含19.5 mmol/L 甘露醇、5.5 mmol/L 葡萄糖的培养基共同培养48 h)、高糖组(含25 mmol/L葡萄糖的培养基孵育48 h)[7]及高糖+红花黄色素低、中、高剂量组(含有25 mmol/L 葡萄糖与0.5、1、2 μmol/L红花黄色素的培养基共同处理48 h)[8]。后续实验分组为高糖+pcDNA组(pcDNA转染至小鼠足细胞，含有5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养48 h)、高糖+pcDNA-FGD5-AS1组(pcDNA-FGD5-AS1转染至小鼠足细胞，加入含有5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养48 h)、高糖+红花黄色素高剂量+si-NC组(si-NC转染至小鼠足细胞，含有5.5 mmol/L葡萄糖与2 μmol/L红花黄色素的培养基共同处理48 h)、高糖+红花黄色素高剂量+si-FGD5-AS1组(si-FGD5-AS1转染至小鼠足细胞，含有5.5 mmol/L葡萄糖与2 μmol/L红花黄色素的培养基共同处理48 h)。

2.2 MTT检测细胞增殖 收集各组MPC5细胞接种于96孔板(每孔1×104个)，每孔添加20 μL MTT溶液，孵育4 h后4 ℃、2 000 r/min离心10 min，吸弃上清，每孔添加150 μL DMSO，25 ℃下避光振荡5 min，检测各孔在490 nm波长处的光密度(OD)值。存活率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 预冷PBS洗涤各组MPC5细胞2次，取500 μL结合缓冲液加到细胞沉淀中，加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，25 ℃下避光孵育10 min，流式细胞仪检测MPC5细胞凋亡率。

2.4 RT-qPCR检测细胞中FGD5-AS1、miR-302a-3p的表达 Trizol法提取MPC5细胞总RNA，反转录合成cDNA后配置反应体系。反应体系为10 μL SYBR Green Master Mix、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、1 μL cDNA、8.2 μL ddH2O。FGD5-AS1以GAPDH为内参，miR-302a-3p以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算FGD5-AS1、miR-302a-3p相对表达量。

2.5 双荧光素酶报告基因检测FGD5-AS1的靶基因 分别将FGD5-AS1野生荧光素酶报告载体(WT-FGD5-AS1)、突变载体(MUT-FGD5-AS1)与miR-NC或miR-302a-3p mimics共转染至MPC5细胞，收集转染48 h细胞，检测荧光素酶活性。

2.6 Western blot检测cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达 MPC5细胞加入RIPA裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，SDS-PAGE分离蛋白，转膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，在25 ℃下分别孵育一抗(1∶1 000稀释)2 h，再孵育二抗(1∶5 000稀释)2 h。曝光，显影，Image J软件分析各条带相对内参GAPDH的灰度值。

3 结果

3.1 红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞增殖及凋亡的影响 与对照组比较，甘露醇组细胞存活率、凋亡率、cleaved caspase-12、cleaved-PARP蛋白表达无明显变化(P>0.05)，表明高渗对细胞活性的影响较小，即可排除高渗对细胞活性的影响；与甘露醇组比较，高糖组细胞存活率降低(P<0.05)，cleaved caspase-12和cleaved-PARP蛋白表达、凋亡率升高(P<0.05)；与高糖组比较，高糖+红花黄色素低、中、高剂量组细胞存活率升高(P<0.05)，cleaved caspase-12和cleaved-PARP蛋白表达、凋亡率降低(P<0.05)，见图1、表1。

表1 红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞增殖及凋亡的影响

注：A为流式细胞术检测红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞凋亡率的影响，B为Western blot法检测红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞cleaved caspase-12以及cleaved-PARP蛋白表达的影响。

3.2 红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞内质网应激损伤的影响 与对照组比较，甘露醇组细胞CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达无明显变化(P>0.05)，即可排除高渗对细胞内质网应激的影响；与甘露醇组比较，高糖组CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达升高(P<0.05)；与高糖组比较，高糖+红花黄色素低、中、高剂量组CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达降低(P<0.05)，见图2、表2。

图2 红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞内CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达的影响

表2 红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞内质网应激损伤的影响

3.3 红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞FGD5-AS1、miR-302a-3p表达的影响 与对照组比较，甘露醇组细胞FGD5-AS1、miR-302a-3p的表达无明显变化(P>0.05)，即可排除高渗对细胞内FGD5-AS1、miR-302a-3p表达的影响；与甘露醇组比较，高糖组FGD5-AS1表达降低(P<0.05)，miR-302a-3p表达升高(P<0.05)；与高糖组比较，高糖+红花黄色素低、中、高剂量组FGD5-AS1表达升高(P<0.05)，miR-302a-3p表达降低(P<0.05)，见表3。

表3 红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞FGD5-AS1、miR-302a-3p表达的影响

3.4 FGD5-AS1过表达对高糖诱导的MPC5细胞增殖、凋亡及内质网应激损伤的影响 与高糖+pcDNA组比较，高糖+ pcDNA-FGD5-AS1组细胞存活率升高(P<0.05)，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α以及GRP78蛋白表达、凋亡率降低(P<0.05)，见图3、表4。

表4 FGD5-AS1过表达对高糖诱导的MPC5细胞增殖、凋亡及内质网应激损伤的影响

注：A为流式细胞术检测FGD5-AS1过表达对高糖诱导的MPC5细胞凋亡率的影响，B为Western blot法检测FGD5-AS1过表达对高糖诱导的MPC5细胞中cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达的影响。

3.5FGD5-AS1靶向调控miR-302a-3pstarBase预测显示FGD5-AS1与miR-302a-3p存在结合位点，见图4。与WT-FGD5-AS1共转染时，与miR-NC组比较，miR-302a-3p组荧光素酶活性降低(P<0.05)；与MUT-FGD5-AS1共转染时miR-NC组与miR-302a-3p组荧光素酶活性比较，荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)，见表5。pcDNA-FGD5-AS1组miR-302a-3p的表达低于pcDNA组(P<0.05)；si-FGD5-AS1组miR-302a-3p的表达高于si-NC组(P<0.05)，见表6。

表5 双荧光素酶报告实验

表6 FGD5-AS1靶向调控miR-302a-3p的表达

图4 FGD5-AS1与miR-302a-3p的结合位点

3.6 干扰FGD5-AS1表达可降低红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞增殖、凋亡及内质网应激的作用 与高糖+红花黄色素高剂量+si-NC组比较，高糖+红花黄色素高剂量+si-FGD5-AS1组细胞存活率降低(P<0.05)，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α及GRP7蛋白表达、凋亡率升高(P<0.05)，见图5、表7。

图5 干扰FGD5-AS1表达联合红花黄色素对cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达的影响

表7 干扰FGD5-AS1表达可降低红花黄色素对高糖诱导的MPC5细胞增殖、凋亡及内质网应激的作用

4 讨论

糖尿病肾病是引起终末期肾病的重要原因之一，其发病机制尚未完全阐明，其主要病理特征为肾小球基底膜增厚，足细胞损伤是糖尿病肾病发生的重要原因之一，高糖处理足细胞后可增加细胞凋亡率，研究表明小柴碱等中药可通过维持足细胞功能稳定性从而减缓糖尿病肾病的发展[9-10]。lnRNA表达异常可通过竞争性结合miRNA从而参与糖尿病肾病、心血管疾病等多种疾病发生及发展过程[11]。关于红花黄色素治疗糖尿病肾病的作用机制及其可能作用靶点尚未阐明。

红花黄色素属于类黄酮化合物，其可用于治疗脑血管疾病等炎症性疾病，研究显示红花黄色素可有效控制肺纤维化发展进程，并可抑制肝癌、乳腺癌细胞增殖及促进细胞凋亡[12-14]。本研究结果显示高糖处理后小鼠足细胞存活率降低，并可促进cleaved caspase-12以及cleaved PARP的表达，促进细胞凋亡，而不同浓度的红花黄色素处理后MPC5细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，并可抑制cleaved caspase-12、cleaved PARP的表达，且随着药物剂量的增加而逐渐变化。当细胞受到凋亡信号刺激时caspase-12被激活剪切为cleaved caspase-12并诱导细胞凋亡，PARP属于细胞凋亡促进因子，其活化形成cleaved-PARP从而促进细胞凋亡[15-16]。提示高糖可诱导小鼠足细胞凋亡及抑制细胞增殖，而红花黄色素可抑制高糖诱导的小鼠足细胞凋亡及促进细胞增殖。内质网应激的重要指标是CHOP、p-eIF2α、GRP78，研究表明内质网应激是引起细胞凋亡的重要途径之一，内质网应激发生时GRP78的生成量增加并可激活CHOP、caspase-12从而诱导细胞凋亡，而PERK与GRP78解体后可激活eIF2α形成p-eIF2α从而促进CHOP表达最终诱导细胞凋亡[17]。本研究结果显示高糖诱导的MPC5细胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达升高，而红花黄色素能降低CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表达，且随着药物剂量的增加而逐渐降低，提示红花黄色素可能通过抑制高糖诱导的小鼠足细胞内质网应激从而抑制细胞凋亡。

FGD5-AS1在OGD/R诱导的神经细胞中表达下调，上调其表达可能通过充当miR-223的海绵分子从而减轻神经元损伤[18]。本研究结果显示高糖诱导的MPC5细胞中FGD5-AS1的表达降低，而不同浓度的红花黄色素处理后小鼠足细胞中FGD5-AS1的表达升高，提示红花黄色素的保护作用可能依赖于FGD5-AS1表达增加。FGD5-AS1过表达后高糖诱导的小鼠足细胞存活率升高，凋亡率降低，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78表达下调，提示FGD5-AS1在糖尿病肾病足细胞损伤中可能发挥保护作用。同时本研究进一步分析显示FGD5-AS1可靶向结合miR-302a-3p，并可负向调控miR-302a-3p的表达，高糖诱导的MPC5细胞中miR-302a-3p的表达升高，而不同浓度的红花黄色素处理后miR-302a-3p表达降低，且随着药物剂量的增加而逐渐降低，提示红花黄色素可能通过调控FGD5-AS1与miR-302a-3p表达从而对小鼠足细胞发挥保护作用。本研究结果显示干扰FGD5-AS1表达与红花黄色素共同处理后，高糖诱导的MPC5细胞存活率降低，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α以及GRP7蛋白表达上调，凋亡率升高。提示干扰FGD5-AS1表达可减弱红花黄色素对高糖诱导小鼠足细胞损伤的保护作用。

综上所述，红花黄色素可通过抑制内质网应激和细胞凋亡来减轻高糖诱导的小鼠足细胞损伤，其作用机制可能与上调FGD5-AS1/miR-302a-3p途径有关。这为阐释红花黄色素治疗糖尿病肾病的分子机制奠定实验基础，还可为明确FGD5-AS1在糖尿病肾病发生过程中的作用机制提供参考依据。