加味龟鹿二仙胶汤对肺癌耐药裸鼠化疗药敏性的改善作用

师 林， 黄圆圆， 柯 斌*

(1.南方医科大学珠江医院中医科，广东 广州 510282；2.中山大学肿瘤防治中心中医科，广东 广州 510060)

肺癌是临床上常见的呼吸系统恶性肿瘤，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌病例的85%左右，由于现代环境和生活方式的改变，其发病率也在增加，已成为严重威胁人类生命和健康的疾病。随着化疗技术的不断成熟，对肺癌的治疗效果大大提高，但5年总生存率仅为10%～15%，长期疗效较差[1]。研究表明，以顺铂为代表的含铂方案是晚期NSCLC的标准辅助治疗策略，但其化疗耐药会影响患者的临床疗效[2]。

肿瘤中调节性T(Treg)细胞的增加会形成免疫抑制性微环境，从而降低抗肿瘤能力，促进肿瘤生长[3]。肺癌耐药相关基因(P-gp、MRP1)的表达在肺癌耐药中扮演了重要的角色[4]，IL-7介导的JAK3/STAT5信号通路在NSCLC顺铂耐药中发挥了重要作用[5]，因此，探索新的逆转NSCLC顺铂耐药的药物或方法已成为当前临床研究的重要方向。中医药在调节免疫、逆转肺癌化疗耐药、减轻化疗毒性反应方面疗效确切，本实验建立气阴两虚型肺癌耐药裸鼠模型，观察加味龟鹿二仙胶汤对其抗肿瘤活性，以及改善肺癌顺铂化疗耐药的机制，以期为后续相关研究提供参考。

1 材料

1.1 药物 加味龟鹿二仙胶汤由西洋参15 g、沙参30 g、黄芪30 g、龟板15 g(先煎30 min)、枸杞子15 g、鹿角胶15 g(烊化)、阿胶15 g(烊化)、当归6 g、三七10 g组成，常规水煎2次，合并煎液，双层纱布过滤，水浴浓缩至含生药量1 g/mL，浓缩后置于4 ℃冰箱中保存备用。所有药材均购自南方医科大学珠江医院中药房，经南方医科大学珠江医院中医科孙晓敏教授鉴定为正品；顺铂(cisplatin，DDP)购自南京制药厂有限公司，批号H20103216。

1.2 动物与瘤株 50只SPF级Balb/c裸鼠，4～5周龄，体质量13～15 g，购自南方医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(粤)2016-0041，实验动物使用许可证号SYXK(粤)2016-0167，饲养于温度(20±2)℃、相对湿度36%的屏障环境中，自由摄食饮水。肺癌耐顺铂细胞株(A549/DDP)，由中山大学动物实验中心提供。

1.3 仪器与试剂 超净工作台(苏州赛恩斯仪器有限公司，型号ESCOACB-4A1)；光学显微镜(日本Olympus公司，型号CX23)；电子天平(沈阳龙腾电子有限公司，型号B200-3)；台式离心机(德国Sigma公司，型号Sigma 1-14 K)；多功能酶标仪(德国BMG公司，型号LUMIstar Omega)；流式细胞仪(美国Thermo Fisher Scientific公司，型号Attune NxT)；PCR基因扩增仪、电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司，型号伯乐T100、伯乐1645050、Trans-Blot Turbo)。FITC anti-mouse CD4抗体、PE anti-mouse CD2抗体(美国Biolegend公司，批号100405、100107)；IL-7 ELISA试剂盒(英国Abcam公司，批号K1051-100)；反转录(RT)试剂盒(美国Invitrogen公司，批号K1622)；Phospho-JAK3抗体、Phospho-STAT5抗体(美国CST公司，批号5031T、4322T)。

2 方法

2.1 模型建立 气阴两虚型小鼠模型制备方法参考文献[6]，症状表现为精神萎靡，反应迟钝，少动，毛色略有干枯、发黄，体质量下降，摄食量减少，饮水量增加，小便黄，大便秘结。肺癌耐药裸鼠模型建立方法参考文献[7]进行，A549/DDP肺癌细胞在37 ℃下复苏后14 000 r/min离心，弃去上清液，以1×107/mL的细胞密度稀释成悬浮液，取0.2 mL，皮下接种至裸鼠左前腋窝皮下，造模后5～7 d皮下可明显扪及肿瘤，表明造模成功。

2.2 分组与给药 50只荷瘤裸鼠按体质量随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组，正常饲养，不造模；模型组，给予生理盐水灌胃，0.4 mL/只，持续3周；顺铂组，腹腔注射顺铂(2 mg/kg)，每周2次，共6次；中药组，按照临床等效剂量(根据人和动物按表面积折算的等效剂量比率表计算[8])，给予灌胃加味龟鹿二仙胶汤19.63 g/kg，持续用药3周；中药+顺铂组，即联合组，给予加味龟鹿二仙胶汤19.63 g/kg，持续用药3周，同时腹腔注射顺铂(2 mg/kg)，每周2次，共6次。

2.3 指标检测

2.3.1 一般情况 给药后，每天观察各组裸鼠食欲、大便、毛色、活动等状况。

2.3.2 脾脏指数、抑瘤率 在第22天颈椎脱臼处死裸鼠，切除肿瘤，分离脾脏组织，计算脾脏指数、肿瘤抑制率，公式为脾脏指数=(脾脏质量/体质量)×100%、抑瘤率=[(模型组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量]×100%。

2.3.3 CD4+CD25+Treg细胞比例 第22天颈椎脱臼处死裸鼠，眼科剪分离取出脾脏，放置在200目不锈钢网上，注射器针芯轻轻研压脾脏，得到细胞悬液，通过流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg细胞比例。

2.3.4 血清IL-7水平 第22天裸鼠眼眶取血，3 000 r/min离心5 min，采用ELISA法检测血清IL-7水平。

2.3.5 肿瘤组织中耐药相关基因(P-gp、MRP1)表达 采用RT-qPCR法，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，逆转录程序为42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min；定量PCR反应程序为95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共40个循环，以GAPDH的CT值作内参，采用2-ΔΔCT法进行样本分析。引物序列为P-gp正向5′-AGCAGAGGATCGCCATTGC-3′，反向5′-CTGAACCACTGCTTCGCTTTC-3′，片段长度105 bp；MRP1正向5′-GCTGTGAAGACCCAGG AGAG-3′，反向5′-AAGCACCAGGAAACCACTTG-3′，片段长度123 bp；GAPDH正向5′-AGAAGGC TGGGGCTCATTTG-3′，反向5′-AGGGGCCATCCA CAGTCTTC-3′，片段长度258 bp。

2.3.6 肿瘤组织中JAK3/STAT5信号通路的蛋白表达 采用Western blot法，含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解细胞，提取肿瘤组织总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒检测其浓度，10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶分离等量蛋白，转移到PVDF膜上，5%BSA封闭，与一抗(1∶300)4 ℃孵育过夜，洗膜后辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶400)孵育1 h，通过ECL化学发光试剂盒检测蛋白信号，通过Image J软件进行定量，以GAPDH为内参蛋白。

3 结果

3.1 一般情况 气阴两虚型肺癌模型组裸鼠出现毛色干枯、发黄、脱毛，精神状态较差，反应迟钝，倦卧懒动，体质量下降，摄食量减少，饮水量增加，小便黄，大便秘结等典型的气阴两虚症状；顺铂组除了上述气阴两虚症状外，还有不同程度的呕吐，整体状态比模型组差；中药组及联合组精神状态较好，反应灵敏，毛色光亮，活动增多，摄食量增加，体质量增加，小便颜色正常，大便接近正常。

3.2 脾脏指数 由表1可见，模型组脾脏指数较正常对照组降低(P<0.01)；中药组脾脏指数较模型组升高(P<0.05，P<0.01)；联合组脾脏指数较顺铂组升高(P<0.01)。

表1 各组脾脏指数

3.3 抑瘤率 由表2可见，顺铂组、联合组瘤重较模型组下降(P<0.01)；中药组抑瘤率较顺铂组下降(P<0.01)，联合组抑瘤率较顺铂组升高(P<0.01)。

表2 各组肿瘤质量及抑瘤率

3.4 脾脏CD4+CD25+Treg/CD4+细胞比值 由表3可见，模型组脾脏CD4+CD25+Treg/CD4+细胞比值高于正常对照组(P<0.01)；中药组、联合组CD4+CD25+Treg/CD4+细胞比值低于模型组(P<0.01)；中药组、联合组CD4+CD25+Treg/CD4+细胞比值较顺铂组降低(P<0.01)。

表3 各组脾脏CD4+ CD25+Treg/CD4+细胞比值

3.5 血清IL-7水平 由表4可见，与正常对照组比较，模型组IL-7水平降低(P<0.01)；与模型组比较，顺铂组IL-7水平降低(P<0.01)；与顺铂组比较，中药组、联合组IL-7水平升高(P<0.01)。

表4 各组血清IL-7水平

3.6P-gp、MRP1 mRNA表达 由图1可见，与正常对照组比较，模型组P-gp、MRP1表达有升高趋势，但无统计学差异(P>0.05)；与模型组比较，顺铂组、中药组、联合组P-gp、MRP1表达降低(P<0.05，P<0.01)；与顺铂组比较，中药组、联合组P-gp、MRP1表达降低(P<0.05，P<0.01)。

注：与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与顺铂组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.7 p-JAK3、p-STAT5蛋白表达 由图2可见，与正常对照组比较，模型组p-JAK3、p-STAT5表达有升高趋势，但无统计学差异(P>0.05)；与模型组比较，顺铂组、中药组、联合组p-JAK3、p-STAT5表达降低(P<0.05)；与顺铂组比较，中药组、联合组p-JAK3、p-STAT5表达降低(P<0.01)。

注：A为JAK3/STAT5信号通路的蛋白表达条带图，B为JAK3/STAT5信号通路的蛋白表达柱状图。与模型组比较，△P<0.05；与顺铂组比较，##P<0.01。

4 讨论

手术和化疗是当前肺癌的主要治疗手段，但经过化疗后患者的免疫功能会有不同程度的影响。中药在抗肿瘤、调节肿瘤患者免疫功能方面具有疗效确切、不良反应少的优势，已成为当下中西医结合研究肿瘤的热点[9]。肺癌顺铂化疗后主要表现为气阴两虚、脾肾亏虚[10]。因此，本研究建立了气阴两虚型肺癌耐药裸鼠模型。加味龟鹿二仙胶汤属于单纯“扶正培本”类方剂，具有益气养阴、补肾填精、养血生髓的功效，在减轻化疗所致的骨髓毒性、增强顺铂敏感性方面疗效确切[11-13]。

目前，肺癌抗肿瘤治疗主要集中在提高患者的抗肿瘤免疫力和直接抑制肿瘤两方面。为了验证加味龟鹿二仙胶汤是否有直接抑制肿瘤作用，在本研究中分析了肿瘤质量和肿瘤抑制率。研究结果表明，单纯加味龟鹿二仙胶汤治疗后的肿瘤质量有一定的下降趋势，但抑瘤率较低(9.27%)，表明加味龟鹿二仙胶汤抑瘤作用较弱，其抗肿瘤作用不是通过直接抑制肿瘤实现的。此外，联合组抑瘤率较顺铂组升高(分别为70.12%和40.25%)，表明中药联合顺铂对肿瘤的抑制作用比单用顺铂的作用更强。

脾脏和胸腺是动物的两个主要免疫器官，也是中枢和外周免疫器官组织的重要组成部分。内脏指数可以反映免疫状态[14]。本研究结果表明，与正常对照组比较，模型组脾脏指数下降，说明肺癌状态下，裸鼠机体处于免疫低下状态；中药组、联合组脾脏指数较模型组升高，说明中药的使用提高了脾脏指数，表明使用中药后裸鼠在细胞免疫方面得到增强。

免疫系统在肺癌的发展和进程中起着至关重要的作用。研究表明，在肺癌细胞的生长过程中存在免疫逃逸，这是肺癌发生、发展的重要因素[15]。Treg细胞在肿瘤免疫逃逸中起重要作用[16]，CD4+CD25+Treg细胞可作为NSCLC患者免疫状态和预后的预测指标[17]。因此，免疫功能在肿瘤治疗中起关键作用[18]。本研究结果表明，模型组CD4+CD25+Treg/CD4+细胞的百分率均高于正常组，提示肺癌裸鼠机体免疫功能处于受抑制状态。中药组、联合组CD4+CD25+Treg/CD4+细胞的百分率均低于模型组；中药组、联合组CD4+CD25+Treg/CD4+细胞的百分率较顺铂组降低，提示加味龟鹿二仙胶汤可以纠正CD4+CD25+Treg细胞比例，解除机体免疫抑制状态，显著提升肺癌裸鼠的免疫功能。

T淋巴细胞分泌的细胞因子与肿瘤之间的关系密切。IL-7是IL-2超家族的成员之一，作为T细胞发育和成熟T细胞稳态的关键细胞因子，可通过促进活化T细胞、B细胞和NK细胞的发育而对肿瘤治疗有益[19]。本研究结果表明，与正常对照组比较，模型组IL-7水平降低，提示肺癌裸鼠体内分泌的细胞因子降低，机体抗肿瘤能力减弱；与顺铂组比较，中药组、联合组IL-7水平升高，提示加味龟鹿二仙胶汤能够促进机体产生细胞因子，增强机体抗肿瘤能力。

IL-7与IL-7受体(IL-7R)结合而发挥作用，IL-7R是由IL-7受体α和γ链组成的异二聚体。IL-7R被发现在多种类型的细胞上表达，在免疫细胞的发育中起关键作用。IL-7介导的JAK/STAT信号通路是涉及肿瘤细胞分化、迁移、增殖和耐药的关键通路之一[5]。P-gp和MRP1表达升高在肺癌顺铂化疗耐药中发挥重要作用[4]。本课题组既往研究发现，与A549细胞相比，A549/DDP细胞中IL-7R的mRNA和蛋白表达均增加，IL-7与IL-7R结合后，酪氨酸激酶JAK1和JAK3被激活，从而导致STAT5激活。本研究结果表明，与顺铂组比较，中药组、联合组P-gp、MRP1基因表达降低，中药组、联合组p-JAK3、p-STAT5蛋白表达降低，提示加味龟鹿二仙胶汤发挥改善肺癌顺铂化疗耐药作用是通过调节IL-7介导的JAK3/STAT5信号通路实现的。

综上所述，加味龟鹿二仙胶汤能够提高脾脏指数，纠正CD4+CD25+Treg细胞比例，解除机体免疫抑制状态，促进机体产生IL-7等细胞因子，调节IL-7介导的JAK3/STAT5信号通路，减少肺癌组织中耐药相关基因(P-gp、MRP1)的表达，显著提升肺癌裸鼠的免疫功能，从而改善肺癌顺铂化疗耐药。