LMP2A、YAP及P27蛋白在鼻咽癌中的表达及与临床病理特征、预后的关系

王 莹，兰艳丽，兰小娇，赵 维

鼻咽癌(NPC)是指发生于鼻咽腔侧壁、顶部的恶性肿瘤，在我国有极高的发生率[1]。NPC可影响患者听觉、视觉，并损伤颅神经，引起涕中带血、鼻塞、耳鸣、复视及头痛等症状，严重影响患者生活质量，而肿瘤转移可致患者死亡[2-5]。NPC发生发展的分子机制引起了学者们的广泛关注[6]。在肿瘤细胞转移及侵袭过程中，上皮间质转化(EMT)起着重要的作用。相关文献表明，外源性表达潜伏膜蛋白2A(LMP2A)在NPC细胞EMT和肿瘤干细胞自我增殖过程中起促进作用，然而其与NPC的关系鲜有报道[7]。Yes相关蛋白(YAP)是近年发现的一种原癌基因，在多种肿瘤中异常表达。此外，P27蛋白作为一种重要的抑癌基因，也是国外学者研究较多的一种预后因子[8]。本研究就LMP2A、YAP及P27蛋白在NPC中的表达及与临床病理特征、预后的关系进行分析，旨在为临床治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2016年1月—2018年1月我院行手术治疗的NPC 90例活检术石蜡标本。纳入标准：术前病理诊断为NPC或鼻咽黏膜慢性炎；患者行手术联合放化疗；临床资料无缺失。排除标准：合并血液系统疾病者；存在除NPC以外其他原发性恶性肿瘤者；合并自身免疫性疾病者。最终81例纳入作为NPC组。同时选取50例本院病理科保存的鼻咽黏膜慢性炎组织标本，排除临床资料不完整、合并其他感染性疾病、合并自身免疫性疾病者，最终46例纳入对照组。2组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 收集所有患者临床资料，比较LMP2A、YAP及P27蛋白在2组中的表达情况；分析LMP2A、YAP及P27蛋白与NPC患者各病理参数间的关系；记录NPC患者在随访时间内是否死亡，采用多因素Logistic回归分析探讨影响NPC患者预后生存的因素，绘制Kaplan-Meier生存曲线研究3项指标对患者预后的影响。

1.3观察指标

1.3.1检测方法：组织标本利用石蜡处理，切成厚5 μm薄片置于载玻片上，37 ℃培养箱中培养12 h，二甲苯脱蜡2次，每次10 min。PBS液漂洗3次，每次3 min，苏木素染色2 min，置于显微镜下观察并计算2组LMP2A、YAP及P27蛋白表达情况。已知阳性组织切片为阳性对照，已知阴性组织切片为阴性对照，PBS液代替一抗为空白对照。

1.3.2LMP2A、YAP及P27蛋白表达判定标准[9]：LMP2A阳性表达定位于胞膜和胞质，YAP、P27蛋白阳性表达定位于胞质和胞核。免疫组织化学染色评判标准：①按阳性细胞占细胞总数的百分比计分：<5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%、≥75%分别计为0～4分；②染色强度评估：无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别计为1～3分；③将①的分值乘以②的分值即为实验结果：阴性(-)表达0分，弱阳性(+)表达1～4分，中度阳性(++)表达4～8分，强阳性(+++)表达8～12分，以(-)及(+)作为低表达，(++)及(+++)作为高表达。

1.4随访方法 自患者手术结束开始随访，共随访2年，截止时间为2020年1月31日或患者死亡。总生存时间为患者手术至死亡的时长[10]。

2 结果

2.12组LMP2A、YAP及P27蛋白表达情况 NPC组LMP2A、YAP高表达率、P27蛋白低表达率高于对照组(P<0.01)，见表1。

表1 鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎患者LMP2A、YAP及P27蛋白表达比较[例(%)]

2.2相关蛋白与NPC患者病理参数的关系 组织高分化、淋巴结无转移、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、无远处转移、非角化性未分化型的NPC患者LMP2A、YAP高表达率及P27蛋白低表达率较组织中低分化、有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、远处转移、非角化性分化型NPC患者低(P<0.05，P<0.01)，见表2。

表2 LMP2A、YAP及P27蛋白与NPC患者病理参数的关系(例)

2.381例NPC患者预后情况 截至随访结束，81例NPC生存54例，死亡27例，病死率为33.33%。

2.4影响NPC患者预后生存的多因素Logistic回归分析 组织分化程度、病理分型、TNM分期、淋巴结转移及LMP2A、YAP、P27蛋白表达情况为NPC患者预后生存的独立危险因素(P<0.05，P<0.01)，见表3。

表3 影响NPC患者预后生存的多因素Logistic回归分析

2.5LMP2A、YAP及P27蛋白对NPC患者预后生存的影响 LMP2A低表达组平均生存时间为(36.55±0.28)个月，高表达组平均生存时间为(31.55±0.22)个月，LMP2A低表达组平均生存时间长于高表达组(P<0.01)。YAP低表达组平均生存时间为(35.98±0.24)个月，高表达组平均生存时间为(31.13±0.24)个月，YAP低表达组平均生存时间长于高表达组(P<0.01)。P27蛋白低表达组平均生存时间为(33.02±0.27)个月，高表达组平均生存时间为(36.93±0.20)个月，P27蛋白高表达组平均生存时间长于低表达组(P<0.01)。见图1。

图1 LMP2A、YAP及P27蛋白对NPC患者预后生存的影响LMP2A为潜伏膜蛋白2A，YAP为Yes相关蛋白,NPC为鼻咽癌

3 讨论

NPC在我国南方高发区位居头颈部恶性肿瘤首位，居所有恶性肿瘤的第8位。因NPC病理类型以非角化型为主，对放疗敏感，但易发生局部和远处转移[11]。近年，随手术及放疗技术发展，NPC生存率显著提高，但近期生存率仍低于80%。本研究显示，截至随访结束，81例NPC病死率为33.33%，说明NPC仍是威胁大众健康的重要疾病[12]。

转移是NPC患者预后不良的主要原因，目前认为NPC的病情进展、预后生存与EB病毒感染关系密切[13]。LMP2A是静止B细胞中唯一可被检查到的EB病毒潜伏感染基因[14]。研究表明，LMP2A在调控细胞一系列生理活动及维持肿瘤干细胞特性等方面均起重要作用，且还能参与Wnt/β-cate-nin、PI3K/Akt、MAPK、ERK和Hedge-hogn等多条信号通路的调控[15]。本研究显示，LMP2A在NPC组织中高表达率显著高于鼻咽黏膜慢性炎组织，说明LMP2A参与了NPC的恶性进展。

YAP是一种多功能的细胞内连接蛋白和转录共激活因子，为Hippo抑癌基因通路的主要效应子，在细胞正常生长发育过程中起重要作用[16]。通过YAP进行的Hippo信号传导可调控干细胞和祖细胞的增殖活性。同时YAP作为一种有效的致癌基因，其表达水平异常会引起肿瘤发生[17]。据相关研究显示，在大肠癌[18]等多种癌细胞中YAP均异常表达。生物学研究表明，过高的YAP表达在肿瘤细胞生长与增殖中均起一定促进作用，且其速度与YAP表达呈正相关[19]。本研究结果显示，YAP在NPC组织中高表达率显著高于鼻咽黏膜慢性炎组织，说明其对NPC的发生、发展及预后有重要影响。

NPC是一种高频率基因CpG岛甲基化肿瘤，肿瘤相关基因的甲基化改变参与了细胞周期调控、DNA修复、细胞凋亡及肿瘤浸润转移等过程。当P27蛋白表达降低或缺失时，可失去负性调控能力，使细胞周期正调控因子活性增强，引起细胞过度增殖甚至癌变[20]。有研究证明，P27蛋白在多种肿瘤中异常表达[21]。本研究采用免疫组织化学染色法鉴定P27蛋白在NPC组织中的表达特性，结果显示，P27蛋白阳性表达定位于胞质及胞核中，与鼻咽黏膜慢性炎组织相比，其在NPC组织中呈显著低表达，证明了P27蛋白在NPC发展过程中的调节作用。

本研究还显示：LMP2A、YAP及P27蛋白与NPC患者组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期、远处转移及病理分型呈显著相关性，且不同LMP2A、YAP及P27蛋白表达情况下Keplan-Meier生存曲线明显不同，LMP2A、YAP低表达组平均生存时间长于高表达组，P27蛋白高表达组平均生存时间长于低表达组，进一步提示LMP2A、YAP及P27蛋白与NPC患者病情恶化程度关系密切，可作为临床评估NPC患者预后的有效指标及潜在治疗靶点。此外，组织分化程度、病理分型、TNM分期、淋巴结转移及LMP2A、YAP、P27蛋白表达情况为NPC患者预后生存的独立危险因素，提示在NPC患者治疗中，应对伴有高危因素者进行针对性干预，以减缓患者病情进展、改善患者预后、延长患者生存时间。

综上，LMP2A、YAP在NPC患者中表达升高，P27蛋白表达降低；LMP2A、YAP高表达及P27蛋白低表达与NPC发生、病情进展及预后有密切联系，可作为预测NPC患者预后的分子标志物和潜在治疗靶点。