右美托咪定对脓毒症小鼠中枢神经炎症反应的调控及机制研究

肖秀英

脓毒症可诱发脓毒症相关性脑病等严重并发症，严重影响患者预后[1]。脓毒症导致的中枢神经系统过度炎症反应为患者长期神经功能认知障碍的发生机制，而小胶质细胞活化在其发生及演变过程中扮演着重要的角色[2-3]。外科手术引发的外周血炎性因子显著升高，其进入中枢神经系统后可导致小胶质细胞异常激活，呈现M1状态，进一步加剧炎症反应[4]。研究证实，在全身炎症反应发生及演变环节中，炎症反应及中枢神经系统小胶质细胞活化后均可严重破坏血脑屏障正常功能[5]。右美托咪定(Dex)目前已被证实可降低术后患者神经认知功能障碍发生风险，显著抑制炎症反应,可能是其保护神经认知功能的主要机制[6]。本研究旨在探究Dex通过减轻脓毒症小鼠外周血和大脑海马区神经炎症反应对神经认知功能恢复的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 51只6～8周CD1小鼠购于北京泰泽嘉业科技发展有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2020-0018。所有小鼠分笼饲养，每笼3只，并置于SPF级动物房中饲养，每12小时昼夜更替，并予充足食物及水，隔日更换垫料1次。

1.2主要试剂与仪器 Dex购于上海吉至生化科技有限公司；伊文氏蓝(EB)购于ChemeGen中国；高迁移率族蛋白1(HMGB1)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)抗体购于武汉益普生物科技有限公司；小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等试剂盒购于上海江莱生物科技有限公司。

1.3实验方法

1.3.1造模与分组：将51只CD1小鼠随机分为假手术组、脓毒症组、Dex组各17只。假手术组小鼠仅行开腹手术及盲肠暴露操作，余2组采用盲肠结扎及穿孔方式建立脓毒症小鼠模型，具体方法：采用异氟烷麻醉小鼠并暴露腹部，剃毛后消毒，由剑突下缘沿腹中线做1 cm切口。分离盲肠并暴露，取4-0手术线于盲肠基底部与盲端连线中点结扎。后通过21 G注射器针头于结扎处与盲端中点实施穿透式穿刺，同时于穿刺点通过无损伤镊子挤出少量粪便。将小鼠盲肠回纳入腹腔，并取6-0丝线缝合，关闭腹腔[7]。建模成功后，Dex组小鼠采用50 μg/kg Dex腹腔注射，建模成功后5 min首次注射，后每隔2 h注射1次，共3次。假手术组、脓毒症组小鼠于相同时间采用6.25 ml/kg生理盐水腹腔注射。

1.3.2巴恩斯迷宫(Barns Maze)测试：术后2周每组随机抽取7只小鼠行Barns Maze测试，分析其空间学习记忆能力(进入目标盒时间)，时间设置为4 d，每日进行2轮，时间为3 min。

1.3.3条件恐惧实验：Barns Maze测试结束后第2日各组随机抽取7只小鼠行条件恐惧实验，比较各组小鼠在环境及声音条件下的僵直时间。

1.3.4血脑屏障通透性检测：术后24 h每组取10只小鼠采用EB实施血脑屏障通透性检测。异氟烷麻醉，断头处死小鼠分离脑组织，冰上快速分离双侧海马组织，经蛋白裂解液裂解后于冰上研磨成组织匀浆，离心后取上清液待检。采用BCA蛋白检测试剂盒测定各组小鼠海马组织蛋白浓度，Western blot法检测HMGB1、RAGE蛋白表达水平。

1.3.5小胶质细胞活化程度：每组取10只小鼠检测小鼠中枢神经系统大脑海马区Iba-1表达水平。

1.3.6炎性因子检测：术后24 h于各组10只小鼠右心室取血，离心后取血清采用ELISA法测定各组小鼠外周血及海马组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

2 结果

2.1各组小鼠空间学习记忆能力比较 1、2、3、4 d时，脓毒症组小鼠进入目标盒时间显著长于假手术组(P<0.05)；Dex组小鼠进入目标盒时间显著短于脓毒症组(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠空间学习记忆能力比较

2.2各组小鼠条件恐惧实验僵直时间比较 在环境及声音条件恐惧实验中，脓毒症组小鼠僵直时间均显著短于假手术组，Dex组小鼠僵直时间均显著长于脓毒症组(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠条件恐惧实验僵直时间比较

2.3各组小鼠大脑海马区EB含量及HMGB1、RAGE蛋白表达水平 假手术组、脓毒症组和Dex组小鼠大脑海马区EB含量分别为(49.96±9.98)、(72.96±15.99)及(56.99±11.23)μg/g，脓毒症组小鼠大脑海马区EB含量显著高于假手术组，Dex组小鼠EB含量显著低于脓毒症组(P<0.05)。脓毒症组小鼠大脑海马区HMGB1、RAGE蛋白表达水平显著高于假手术组，Dex组小鼠HMGB1、RAGE蛋白表达水平显著低于脓毒症组(P<0.05)。见图1。

图1 各组小鼠大脑海马区HMGB1、RAGE蛋白表达水平Dex为右美托咪定，HMGB1为高迁移率族蛋白1，RAGE为晚期糖基化终末产物受体；与假手术组比较，aP<0.05；与脓毒症组比较，bP<0.05

2.4各组小鼠大脑海马区小胶质细胞活化程度比较 假手术组、脓毒症组和Dex组小鼠大脑海马区Iba-1表达水平分别为(1.76±0.20)、(6.08±0.35)和(2.49±0.11)μg/g。脓毒症组小鼠大脑海马区Iba-1表达水平显著高于假手术组，Dex组小鼠Iba-1表达水平显著低于脓毒症组(P<0.05)。

2.5各组小鼠外周血及大脑海马区TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较 脓毒症组小鼠外周血及大脑海马区TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著高于假手术组(P<0.05)；Dex组小鼠外周血及大脑海马区IL-6、IL-1β水平均显著低于脓毒症组(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠外周血及大脑海马区TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较

3 讨论

PRESCOTT和ANGUS[8]研究显示，血脑屏障损伤在脓毒症相关性脑病病理生理过程中扮演着重要角色，其通透性升高可导致大量炎性介质进入中枢神经系统，增强中枢神经系统炎症反应[9]。小胶质细胞处于M1状态时被公认为是中枢神经系统炎症反应的“效应放大器”[10]。WANG等[11]研究显示，小胶质细胞活化后可分泌HMGB1，并作为RAGE配体存在；HMGB1可激活血管内皮细胞中的RAGE蛋白，并进一步加剧血管内皮细胞氧化应激反应，最终导致血脑屏障破坏。

有学者分别采用丙泊酚及Dex对区域阻滞髋关节手术患者进行干预，结果发现经Dex干预患者较丙泊酚干预患者术后神经认知功能恢复佳[12]。KONG等[13]发现Dex可显著减少脂多糖诱导的脓毒症动物模型中枢神经系统炎症反应，同时可抑制中枢神经系统小胶质细胞活化。MEI等[14]研究证实，Dex可显著缓解外源性HMGB1诱发的神经认知功能障碍，有利于改善血脑屏障损伤。GAO等[15]研究显示，Dex可阻断激活后的小胶质细胞分泌炎性因子，且该功能可被α2肾上腺素受体阻断剂逆转，说明Dex可直接调控小胶质细胞功能。

本结果显示，脓毒症可诱发小鼠大脑海马区神经炎症反应，并导致血脑屏障通透性升高，外周血及大脑海马区TNF-α、IL-6、IL-1β水平和中枢神经系统小胶质细胞活化程度升高，除此之外，大脑海马区HMGB1、RAGE蛋白表达水平亦显著增加，加重了神经功能障碍。XING等[16]研究显示，中枢神经系统炎症可诱发学习记忆能力障碍。QIU等[17]报道表明，采用剖腹探查术及异氟烷麻醉可加剧中枢神经系统炎症反应，进而导致小鼠神经认知功能障碍。而本实验发现Dex经腹腔注射后不仅可明显缓解脓毒症小鼠外周炎症反应，还可改善小鼠大脑海马区炎症反应，此时大脑海马区小胶质细胞活化程度及HMGB1、RAGE蛋白表达水平随之降低。除此之外，我们还发现Dex可改善脓毒症诱发的血脑屏障损伤，有利于促进小鼠神经认知功能恢复。

综上，Dex可改善脓毒症小鼠外周和大脑海马区神经炎症反应，减轻脓毒症导致的血脑屏障通透性升高程度，有利于促进神经认知功能的恢复。