基于miR-93-5p/PTEN轴利拉鲁肽对MI/R大鼠心肌细胞氧化应激的影响

刘 娜 刘 斌 曹广林

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion，MI/R)损伤造成的氧化应激、炎性反应等，可导致心肌细胞凋亡、心肌纤维化，引起心功能障碍[1,2]。利拉鲁肽(liraglutide，LIR)是一种人胰高糖素样肽-1类似物，LIR可降低氧化应激水平，抑制高糖诱导的髓核细胞凋亡，还可抑制内皮细胞炎性反应，改善内皮功能障碍[3,4]。在MI/R中LIR具有抑制心肌细胞凋亡、改善心功能障碍的作用[5]。miR-93是一种微小核糖核酸(microRNA，miRNA)，在心肌梗死模型中具有促进血管再生、抑制心肌细胞凋亡和心肌纤维化、改善心功能障碍的作用[6]。但LIR能否通过miR-93发挥心脏保护作用仍需进一步研究，本研究建立MI/R大鼠模型，探讨LIR抗心肌损伤作用，为临床治疗提供参考。

材料与方法

1.实验动物和细胞系：SPF级雄性SD大鼠，60只，8周龄，体质量180～200g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SYXK(京)2017-0033；H9C2心肌细胞系购自美国ATCC公司。

2.试剂和仪器：LIR(丹麦诺和诺德制药公司)；anti-miR-93-5p和miR-93-5p mimic(美国RiboBio公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB)，心肌肌钙蛋白I(cardiac troppnin I，cTnI)试剂盒(英国朗道公司)；兔抗大鼠第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)，磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，蛋白丝/苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase B，Akt)、p-Akt抗体(英国Abcam公司)；小动物呼吸机(中国瑞沃德生命科技有限公司)。

3. 分组与给药：60只大鼠随机分sham组、MI/R组、LIR组、anti-miR-93-5p组和anti-miR-93-5p+LIR组，每组12只。LIR组和anti-miR-93-5p+LIR组皮下注射LIR 70μg/kg，1次/天，连续8天，sham组、MI/R组和anti-miR-93-5p组皮下注射0.9%氯化钠注射液；第5天，anti-miR-93-5p组和anti-miR-93-5p+LIR组心肌内注射anti-miR-93-5p 200μl，sham组、MI/R组和LIR组大鼠注射0.9%氯化钠溶液。第8天给药后2h，除sham组外，其余大鼠结扎左冠状动脉前降支，以ST段抬高、左心室前壁变苍白为结扎成功，60min后松开结扎线灌注4h。sham组大鼠仅在左冠状动脉前降支相同部位挂线，但不结扎，其余操作同上。

4.ELISA法检测心肌损伤指标：分别在冠状动脉结扎前、结扎60min后、灌注4h后3个时间点检测心肌损伤指标，结扎前及结扎60min后两个时间点采取内眦静脉血，灌注4h后主动脉采血，3000r/min，离心15min，收集上清。根据ELISA试剂盒说明书进行上样、孵育、洗涤、显色，加入终止液后将96孔板置于酶标仪上，450nm波长处读取吸光度(A)值，根据标准品制作标准曲线，计算血清中LDH、CK-MB、cTnI含量。

5.TUNEL染色检测心肌细胞凋亡：采血完毕，取部分心肌组织，4%多聚甲醛固定24h，脱水、包埋、切片，二甲苯透明，脱水，蛋白酶K室温孵育20min，3%H2O2孵育10min，TUNEL混合液37℃孵育1h。50μl POD标记的抗荧光素抗体37℃孵育30 min，DAB显色、苏木精复染，脱水、透明、封片后光学显微镜下观察。随机选取6个视野，计算心肌细胞凋亡指数(apoptotic index，AI)，AI(%)=(阳性细胞数/细胞总数)×100%。

6.氧化应激指标测定：取部分心肌组织，剪碎，加入抑肽酶后煮沸10min，4℃ 3000r/min离心15min，收集上清液。黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，均按照试剂盒说明书进行。于波长550nm处测定A值并计算SOD活性，波长532nm处测定A值并计算MDA含量。

7.RT-PCR检测miR-93-5p水平：取部分心尖组织，液氮研磨。Trizol法提取总RNA，测定RNA浓度和纯度，反转录cDNA，反应体系：Taq酶10μl，上下游引物各0.8μl，以cDNA为模板 2μl进行qPCR，反应条件：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。以U6为内参，实验数据采用2-△△CT法。引物序列详见表1。

表1 PCR反应引物序列

8.双荧光素酶报告基因测定PTEN和miR-93-5p的靶向关系：分析预测miR-93-5p的靶基因及两者结合位点，扩增miR-93-5p和PTEN的结合片段，并将该片段插入pcDNA中，构建野生(wt)型和突变(mut)型质粒PTEN质粒，与miR-93-5p mimic、NC共转染H9C2心肌细胞。按照Luciferase报告基因试剂盒说明书检测各组荧光素酶活性。

9.蛋白印迹法检测心肌组织中PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表达：取40mg左右心肌组织，匀浆，RIPA裂解。4℃ 12000r/min离心10min，离心半径为10cm，收集上清。BCA法测定蛋白浓度，加入溴酚蓝后煮沸使蛋白变性。120V恒压电泳1.5h，每孔上样20μl，TBST洗膜3次，每次5min，封闭2h，PTEN、PI3K、Akt、p-Akt一抗(1∶1000)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5min，二抗(1∶5000)室温孵育2h后，TBST洗膜3次，每次5min，ECL显色法显色。Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与GAPDH蛋白条带灰度值的比值，作为目的蛋白相对表达水平。

结 果

1.LIR减轻MI/R大鼠心肌损伤：冠状动脉结扎前、结扎60min后及再灌注4h后，ELISA法检测血清中心肌损伤指标的含量。冠状动脉结扎前CK-MB、LDH、cTnI组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结扎60min后及再灌注4h后，与sham组比较，MI/R组CK-MB、LDH、cTnI均升高(P<0.05)；与MI/R组比较，LIR组CK-MB、LDH、cTnI均降低，anti-miR-93-5p组CK-MB、LDH、cTnI均升高(P<0.05)；与LIR组比较，anti-miR-93-5p+LIR组CK-MB、LDH、cTnI均升高(P<0.05)；与anti-miR-93-5p组比较，anti-miR-93-5p+LIR组CK-MB、LDH、cTnI均降低(P<0.05，表2)。

2.LIR降低MI/R大鼠心肌细胞AI：冠状动脉左前降支结扎60min再灌注4h后，TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况。与sham组比较，MI/R组心肌细胞AI升高(P<0.05)；与MI/R组比较，LIR组心肌细胞AI降低，anti-miR-93-5p组心肌细胞AI升高(P<0.05)；与LIR组比较，anti-miR-93-5p+LIR组心肌细胞AI升高(P<0.05)；与anti-miR-93-5p组比较，anti-miR-93-5p+LIR组心肌细胞AI降低(P<0.05，表3)。

表3 心肌细胞AI比较

3.LIR降低MI/R大鼠心肌组织氧化应激水平：冠状动脉左前降支结扎60min再灌注4h后，检测心肌组织中氧化应激指标。与sham组比较，MI/R组MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；与MI/R组比较，LIR组MDA含量降低，SOD活性升高，anti-miR-93-5p组MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；与LIR组比较，anti-miR-93-5p+LIR组MDA含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；与anti-miR-93-5p组比较，anti-miR-93-5p+LIR组MDA含量降低，SOD活性升高(P<0.05,表4)。

表4 心肌组织中MDA含量和SOD活性比较

4.LIR提高MI/R大鼠miR-93-5p表达：冠状动脉左前降支结扎60min再灌注4h后，PCR法检测心肌组织中miR-93-5p的表达。与sham组比较，MI/R组miR-93-5p表达降低(P<0.05)；与MI/R组比较，LIR组miR-93-5p表达升高，anti-miR-93-5p组miR-93-5p表达降低(P<0.05)；与LIR组比较，anti-miR-93-5p+LIR组miR-93-5p表达降低(P<0.05)；与anti-miR-93-5p组比较，anti-miR-93-5p+LIR组miR-93-5p表达升高(P<0.05，表5)。

表5 心肌组织中miR-93-5p水平比较

5.miR-93-5p靶向作用于PTEN：将miR-93-5p mimic、NC、PTEN mut或PTEN wt转染H9C2细胞后，双荧光素酶报告基因检测荧光素酶相对活性。结果显示，转染miR-93-5p mimic后PTEN wt的荧光素酶活性降低，而对PTEN mut的荧光素酶活性无影响(图1，表6)。

图1 PTEN和miR-93-5p结合位点

表6 荧光素酶相对活性比较

6.LIR对心肌组织中PTEN、p-Akt、PI3K蛋白的影响：冠状动脉左前降支结扎60min再灌注4h后，蛋白印迹法检测心肌组织中蛋白表达。与sham组比较，MI/R组PTEN蛋白表达升高，p-Akt、PI3K蛋白表达降低(P<0.05)；与MI/R组比较，LIR组PTEN蛋白表达降低，p-Akt、PI3K蛋白表达升高(P<0.05)，anti-miR-93-5p组PTEN蛋白表达升高，p-Akt、PI3K蛋白表达降低(P<0.05)；与LIR组比较，anti-miR-93-5p+LIR组PTEN蛋白表达升高，p-Akt、PI3K蛋白表达降低(P<0.05)；与anti-miR-93-5p组比较，anti-miR-93-5p+LIR组PTEN蛋白表达降低，p-Akt、PI3K蛋白表达升高(P<0.05)。Akt组间比较，差异无统计学意义(P>0.05,表7，图2)。

图2 心脏组织中各蛋白检测A.sham组；B.MI/R组；C.LIR组；D.anti-miR-93-5p组；E.anti-miR-93-5p+LIR组

讨 论

MI/R时由于线粒体功能受损，氧化应激水平升高，进一步加重心肌损伤，导致心肌细胞凋亡，心脏收缩和舒张功能障碍[7,8]。miRNA参与调节细胞凋亡、细胞自噬、DNA修复等多种生理过程。LIR可降低糖尿病小鼠心肌细胞氧化应激水平、减轻高血压小鼠心肌纤维化、抑制心肌细胞凋亡，改善心功能障碍[9,10]。LIR调节JAK/STAT信号通路在1型糖尿病中发挥抗炎作用，而且LIR通过下调miR-124a减轻非酒精性脂肪性肝病[11，12]。本研究通过建立MI/R大鼠模型，探讨LIR是否作用于miR-93-5p，降低氧化应激水平，改善心肌损伤。

CK-MB、LDH、cTnI作为心肌损伤的标志物，已经成为临床上评估心肌损伤的金标准。本研究中冠状动脉结扎前大鼠心肌损伤指标比较差异无统计学意义，冠状动脉结扎60min后及再灌注4h后大鼠CK-MB、LDH、cTnI、AI均升高，LIR预处理降低血清中CK-MB、LDH、cTnI的含量及AI，表明LIR可改善MI/R大鼠心肌损伤。研究表明，细胞氧化应激水平升高常表现为MDA含量升高，SOD活性降低[13,14]。本研究MI/R时MDA含量升高，SOD活性降低，LIR可降低MDA含量，增强SOD活性，提示LIR降低MI/R大鼠心脏组织氧化应激水平。

miR-93具有促细胞再生、抗细胞凋亡的作用[15,16]。本研究MI/R大鼠心肌组织中miR-93-5p水平降低，应用LIR后miR-93-5p水平升高，说明LIR可能通过上调miR-93-5p，发挥心肌保护作用。研究发现，PTEN/PI3K/Akt信号通路激活具有抑制MI/R大鼠心肌细胞凋亡、减轻四氯化碳诱导的肝脏纤维化、改善心肌缺血造成的心功能障碍[17～19]。本研究结果显示，MI/R大鼠心肌组织中PTEN/PI3K/Akt信号通路蛋白表达异常，LIR对该通路具有调节作用，为进一步了解LIR是否通过miR-93-5p调节PTEN/PI3K/Akt信号通路减轻MI/R大鼠心肌损伤，MI/R大鼠心肌内注射anti-miR-93-5p后皮下注射LIR，双荧光素酶报告基因法证明miR-93-5p与PTEN具有直接靶向关系，蛋白印迹法证明MI/R大鼠心肌组织中miR-93-5p表达下调时，PTEN蛋白表达降低，PI3K、p-Akt蛋白表达升高，给予LIR后逆转miR-93-5p下调对PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表达的影响，提示miR-93-5p可能参与LIR对PTEN/PI3K/Akt信号通路的调节。

综上所述，LIR通过上调miR-93-5p，靶向调节PTEN，发挥抗氧化应激作用，从而改善MI/R大鼠心肌损伤，为临床治疗MI/R提供实验依据。