自噬和铁死亡在动脉粥样硬化中的研究进展

彭 琪 关秀茹

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种随年龄增长呈渐增性的病变,由AS引起的心脑血管疾病依然是全球人类最主要的死亡原因,严重威胁着人们的健康和生命[1]。迄今为止,国内外进行大量关于细胞死亡途径在AS中作用的研究，其中铁死亡和自噬是近年来研究的热点。铁死亡一开始被认为是一种区别于其他程序性死亡的铁依赖性死亡，且有研究表明，铁死亡在AS中发挥了重要的作用。Bai等[2]在载脂蛋白E敲除(apolipoprotein E-/-,APOE-/-)的小鼠中，对高脂饮食(high-fat diet，HFD)喂养的小鼠施用铁死亡抑制剂ferrostatin-1，结果表明，ferrostatin-1可以减轻HFD喂养的APOE-/-小鼠的AS病变。中医学也有研究发现，二陈汤合桃红四物汤能明显改善APOE-/-小鼠的AS进展情况，其机制可能与其调控抗氧化因子介导的抗氧化损伤及抑制细胞铁死亡有关[3]。此外，铁死亡激活剂Erastin可增加人血管内皮细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生继而发生铁死亡，血管内皮细胞的死亡在推动AS进展中发挥了重要作用[4]。上述实验结果都有力地证实了铁死亡对AS进展的影响是至关重要的。

自噬是一种有利于细胞内物质周转的亚细胞过程，其对于抵抗应激环境、提供细胞代谢需要具有重要作用。而其失调则涉及多种疾病，如自噬缺陷或异常与AS斑块的发生、发展密切相关。有研究表明，敲除自噬相关基因5(autophagy related gene 5,ATG5)和自噬相关基因7(ATG7)可降低细胞内铁水平和脂质过氧化从而抑制铁死亡激活剂Erastin诱导的铁死亡，所以在特定的环境下铁死亡被认为是一种自噬依赖性死亡[5]。本文将通过介绍自噬和铁死亡的机制引出自噬依赖性铁死亡的机制，从而进一步说明自噬和铁死亡在AS中的作用。

一、自噬的机制

自噬是细胞内一种正常的代谢过程，自噬通过降解细胞内受损的细胞器及相关蛋白质，将分解产生的产物释放，以便这些物质的再次利用，维持细胞内环境的稳态。尤其是在应激的环境下，自噬作用可以帮助细胞适应环境的变化，维持细胞内环境的稳态，从而保护细胞免受损害和死亡。细胞自噬的过程起始于内质网和高尔基体囊泡将细胞质中的线粒体、内吞体、过氧化物酶体等细胞器包被，并最终形成初始自体吞噬泡，胞内体与初始自体吞噬泡融合后形成中间自体吞噬泡，接着溶酶体再与初始自体吞噬泡融合，最终形成降解自体吞噬泡，初始自体吞噬泡中的内容物和内膜被溶酶体内各种酶降解，最终完成细胞自噬[6]。

细胞内的自噬可以区分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。巨自噬是由双层膜结构包绕受损细胞器和蛋白质而构成的自噬体，随后其与溶酶体的结合是一个“自食”的过程。微自噬是一种比较复杂的通过液泡与溶酶体对受损细胞器进行选择性降解的过程。分子伴侣介导的自噬是一种具有强特异性的选择性自噬，并且被选择的可溶性蛋白需逐个进入溶酶体，从而在溶酶体内被消化掉。最初，自噬被认为是细胞面对应激时的一种良性反应，自噬的缺陷可以促进肿瘤、代谢性疾病等多种疾病的进展。但是最近有越来越多的研究表明，不仅自噬的缺陷会导致疾病的进展，过度自噬以及一些选择性自噬也会通过不同的途径导致疾病的进一步发展。

二、铁死亡的机制

1.铁蓄积：铁元素是人体物质合成和代谢不可或缺的，机体内的铁以3价铁(Fe3+)和2价铁(Fe2+)两种氧化态存在，血清中Fe3+与转铁蛋白结合后被转铁蛋白受体(transferrin receptor/transferrin receptor 1，TFRC/TFR1)识别从而转运到细胞内，Fe3+在内质网中被金属还原酶(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate3,STEAP3)还原为Fe2+，然后由溶质载体家族11成员2(solute carrier family 11member 2,SLC11A2)释放到细胞质的不稳定铁池内，多余的Fe2+与铁蛋白轻链(ferritin light chain,FTL)和铁蛋白重链1(ferritin heavy chain1,FTH1)结合。这些铁相关蛋白的代谢和功能异常可导致细胞内铁超负荷，过量的游离铁会与过氧化氢产生芬顿反应生成羟自由基和ROS，从而诱导铁死亡[7]。铁稳态的主要转录调节因子铁结合调节蛋白2(iron responsive element binding protein 2,IREB2)可显著增加储铁蛋白FTL和FTH1的表达，从而抑制Erastin诱发的铁死亡。使用不同类型的铁死亡激活剂时,细胞内铁水平会增高，用细胞内铁螯合剂去铁胺则可阻止铁死亡的发生[8]。上述研究进一步证明了铁蓄积是引起细胞铁死亡的主要原因。

2.脂质过氧化：胱氨酸/谷氨酸反向转运体(cysteine/glutamate antiporter system，System Xc-)是细胞内重要的转运体，它可使被转移到细胞内的胱氨酸还原为半胱氨酸，然后半胱氨酸可以参与谷胱甘肽(glutathione,GSH)的产生，GSH为机体内重要的还原性物质，可以参与体内脂质过氧化物等氧化物的还原反应。Sun等[9]研究发现，核因子NF-E2相关因子(nuclear-factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)可以通过促进System Xc-的表达，从而在阻断氧化损伤介导的铁死亡中起重要作用。此外，溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)参与System Xc-的组成,自噬相关基因BECN1通过结合SLC7A11可以降低System Xc-的合成，从而降低了System Xc-的抗氧化特性促进了铁死亡的发生[10]。

谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)是介导脂质过氧化物还原反应的关键酶，其在铁死亡过程中起关键作用。谷胱甘肽过氧化物酶4抑制剂RSL3(ras-selective-lethal compound 3)通过与GPX4的共价结合抑制GPX4的活性，导致脂质过氧化物的积累及铁死亡。此外，转录激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)激活热休克蛋白5(heat shock protein 5,HSP5)，HSP5与GPX4的结合阻止了GPX4的消除从而抑制了铁死亡[11]。由此可见，脂质过氧化作用是引起铁死亡的重要机制。

三、自噬与铁死亡的关联性

自噬是调节细胞内稳态的关键因子，适度的自噬可以增加细胞在应激状态下的存活率，但高水平的自噬尤其是选择性自噬以及溶酶体活性受损会促进铁死亡的发生。自噬驱动铁死亡的机制详见图1。

图1 自噬驱动铁死亡的机制

1.NCOA4相关的自噬与铁死亡：铁自噬(ferritinophagy)属于一种选择性自噬，它是由核受体共激活因子4(nuclear receptorcoactivator 4,NCOA4)所介导的[12]。研究表明，NCOA4作为选择性货物受体将铁蛋白递送到自噬溶酶体，使铁蛋白降解释放出游离铁，从而促进铁死亡[13]。NCOA4的丰度通过自噬和泛素蛋白酶体系双重控制,过量铁促进泛素依赖性NCOA4转换，并涉及NCOA4与E3泛素连接酶2(the herc domain and rcc-1 like domain2，HERC2)之间的铁依赖性相互作用[14]。研究表明，铁自噬介导的铁死亡在许多疾病中都发挥了重要的作用[15]。

2.RAB7A相关的自噬与铁死亡：虽然铁死亡是以铁蓄积和脂质过氧化为主的细胞死亡形式，但Bai等[16]提出脂滴在细胞死亡过程中起到抗氧化作用，细胞内脂滴的自噬降解，促进肝细胞中RSL3诱导的铁死亡。而肿瘤蛋白D52(tumor protein D52，TPD52)可上调脂滴的形成，从而抑制铁死亡激活剂RSL3的作用。RAS相关蛋白7a(ras associated protein 7a，RAB7A)是RAS癌基因家族的成员,可促进脂滴在溶酶体募集，使脂滴发生自噬降解。抑制ATG5和RAB7A依赖性脂质降解可防止RSL3诱导的脂质过氧化导致的铁死亡。

3.SQSTM1相关的自噬与铁死亡：钟表性自噬(clockophagy)是 Liu等[17]研究发现的一种选择性自噬类型，即有生物钟调节剂芳香烃受体核转位因子样蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like,ARNTL)参与的降解过程，在ARNTL降解过程中选择性结合分子1(sequestosome-1,SQSTM1/P62)为运载ARNTL进行自噬降解的载体受体，ARNTL降解后可阻碍缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)介导的细胞对脂肪酸以及脂质的吸收，这些脂类的吸收可以导致脂质过氧化引发的铁死亡。部分铁死亡促进剂可激活运载ARNTL降解的货物受体，导致ARNTL含量减低从而引发铁死亡。此外，Yang等[18]在细胞和动物模型中的研究表明，ARNTL通过抑制egl-9家族缺氧诱导因子2(egl nine homolog 2,EGLN2/PHD1)的转录来转录激活因子HIF-1α从而抑制铁死亡的发生。

4.BECN1相关的自噬与铁死亡：BECN1与Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶的结合是组成BECN1相关性自噬的基础。BECN1是调节自噬的关键因子，腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activated protein kinase，AMPK)触发的BECN1的磷酸化不止可以促进自噬，还可以与SLC7A11结合，导致System Xc-合成受阻，抑制System Xc-活性从而导致铁死亡[19]。这表明BECN1相关性自噬在调节铁死亡中发挥了一定作用。

5.自噬不足——启动NRF2介导的铁死亡：NRF2在以往的研究中一直被视为抗氧化的主要调节剂，NRF2可通过促进铁的储存，减少铁的吸收和ROS的产生来抑制铁死亡[20]。Zang等[21]研究发现，糖尿病会导致心肌细胞自噬不足，从而关闭NRF2介导的抗氧化防御作用，同时启动NRF2操纵的铁沉积和脂质过氧化，导致铁死亡的发生。并且铁死亡诱导剂Erastin抑制了自噬通量，表明自噬抑制作用可能在NRF2介导的铁死亡中发挥了重要作用。

四、自噬和铁死亡在AS中的作用

1.自噬对AS的双重调控：AS是由血管内皮下脂质堆积及泡沫细胞形成而造成的慢性炎症性疾病。代谢应激、缺氧、炎性细胞因子和氧化脂质等可促进动脉粥样硬化斑块(atherosclerotic plaque,AP)中细胞的死亡以及死亡细胞清除的缺陷。早在几十年前人们通过电镜分析及自噬标志物的表达进行研究，发现自噬可发生于AP的巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞中。

最初人们对AS中自噬的认识局限于其可阻碍疾病进程的有利一面。有研究表明，在AP形成早期，自噬由炎症、氧化应激等多种因素作用被激活，其作为一种保护机制，通过降低AS中泡沫细胞内脂滴的积累和ROS水平、促进损伤后细胞成分的降解维持细胞的正常存活、抑制炎性反应和促进胆固醇流出而起到抗AS的作用。

近年来大量研究证实，自噬在AS进程中对AS的调控具有双向性作用[1]。基础水平的自噬保护AP的细胞，使其免受各种应激环境的影响。而AS晚期时自噬失调以及过度水平的自噬可以促进AP的形成及破裂。在AS晚期，严重应激时可以引起自噬体的形成缺陷或自噬体与溶酶体融合降解过程中的缺陷，自噬缺陷会破坏脂质代谢平衡, 促使脂质在血管壁沉积, 显著增加AP形成。然而，过度自噬可以导致炎性细胞因子的释放和严重的氧化应激以及自噬蜡样体的形成，自噬蜡样体是由氧化脂质和蛋白质结合的复合体，其无法被溶酶体消化，还会使自噬体与溶酶体的结合受限，使平滑肌细胞胶原纤维合成减少导致纤维帽变薄，使内皮细胞死亡促进血栓形成以及使巨噬细胞死亡增加AP的负荷及不稳定性。尤其是过度的选择性自噬还可以介导细胞发生铁死亡，加重AS的进展。

2.铁死亡促进AS的进展：铁死亡是铁依赖性脂质过氧化引起的非凋亡性程序性细胞死亡，其可以导致非酒精性脂肪性肝炎、心肌病、肾缺血-再灌注和神经退行性疾病等复杂疾病的发展。最近铁死亡被证实是AS中细胞死亡形式的其中一种，其特征在于铁依赖性脂质过氧化物的积累达到细胞致死水平，它可以促进血管内皮细胞和平滑肌细胞等AS相关细胞的泡沫化和死亡。血管内皮细胞的损伤和死亡与多种血管疾病如AS等有关。有研究表明，铁超载可导致血管内皮细胞遭受 ROS和脂质过氧化的损伤，Erastin导致的GPX4下调和ACSL4上调使AS中内皮细胞发生铁死亡，加重了AS的发展[4]。此外，铁过载还可通过促进AS中泡沫细胞形成和炎性反应，损伤平滑肌细胞等作用加重AS斑块的形成和不稳定性[22]。有研究发现，在经氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,OX-LDL)处理的小鼠主动脉内皮细胞(mouse aortic endothelial cells，MAECS)中，ferrostatin-1抑制了铁过载状态和脂质的过氧化，并且增强了SLC7A11和GPX4的活性，提高了细胞的活力并且减少了细胞的死亡[2]。然而，铁螯合剂去铁蛋白原(desferricoprogen,DFC)抑制了斑块脂质的氧化减少了致AS饮食的APOE-/-小鼠中的斑块形成[23]。上述研究都说明了铁死亡在AS中的重要作用，所以通过减弱AS中的铁蓄积和脂质过氧化作用，从而抑制铁死亡来减轻AS有望成为治疗AS的新靶点。

3.自噬和铁死亡在AS中的关联性：p62是一种多功能的支架蛋白，其在选择性自噬中把泛素化的蛋白携带到自噬小体上进行降解，同时自身也被降解。来自AS小鼠的主动脉和来自人类动脉内膜切除术样品的斑块显示，与斑块巨噬细胞共定位的p62和多泛素化蛋白的丰度增加，表明富含p62的蛋白聚集体是AS的特征[24]。研究表明，巨噬细胞中加入大量的OX-LDL可以阻断自噬通量，导致p62聚集， 然后p62 通过依赖于NF-κB的信号转导参与基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)基因的表达，从而具有AP的新斑块易损性特征。然而，这一过程中p62的丰度的增加也极有可能导致p62介导的钟表性自噬的增强，这种选择性自噬会使ARNTL降解增加，促进脂质过氧化和随后的铁死亡，从而导致斑块稳定向下降，加快AS的进展。

自噬调节基因BECN1是可以通过泛素化修饰对自噬进行调节的关键因子。有证据表明，BECN1在AS的内皮细胞中是发挥保护作用的，敲低BECN1可以抑制OX-LDL处理的人脐静脉内皮细胞中的自噬，使细胞的生存率减低，加重AP的不稳定性[25]。BECN1被敲低还可以增强System Xc-的合成和抗氧化作用，从而抑制铁死亡的发生，所以BECN1对AS的保护作用也体现在其对细胞自噬和铁死亡的调控作用上。

NRF2在心血管系统中普遍表达，NRF2是通过抑制氧化应激来维持心血管稳态的关键调节因子。但在AS晚期，血管平滑肌细胞发生自噬缺陷，自噬缺陷能够引发NRF2的非经典激活导致NRF2的持续活化，NRF2的异常激活会加重细胞炎性反应、促进细胞死亡，具有致病性[26]。综上所述，自噬依赖性铁死亡相关因子在AS中发挥了重要的作用，有望在疾病中将自噬和铁死亡联系起来成为AS治疗的新靶点。

五、展 望

迄今为止，已经发现了许多细胞死亡途径，它们可以相互配合以维持机体动态平衡。阐明它们的分子机制和每种途径之间的串扰不仅有利于对细胞死亡途径的全面了解，还为相关疾病治疗开辟了新的方法。本文重点介绍了自噬和铁死亡的机制以及其与AS之间的联系，证实自噬与铁死亡对AP稳定性的维持有重要的影响。笔者研究发现自噬和铁死亡之间存在串扰作用，铁死亡实际上是一种自噬依赖性死亡方式，并且列举了其在AS中具有潜力的研究方向。然而，对自噬依赖性铁死亡的分子机制和病理基础的认识仍然不够系统和全面，所以自噬介导铁死亡的具体机制还需进一步探究。此外，如何定义何种阈值程度的自噬会导致铁死亡是一个值得思考的难题。虽然有研究表明自噬与铁死亡以及联系二者的部分细胞因子在AS中都发挥了重要作用，但其确切机制还有待进一步探究。