自噬对骨质疏松的影响及中药的调控作用研究进展

李玉曼 马紫童 王 瀚 刘仁慧

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，骨脆性增加，易发生骨折的一种全身性骨骼疾病。其发病机制主要在于骨形成和骨吸收间的动态平衡的破坏。随着我国进入老龄化社会，OP的发生率日益增高，严重影响患者身体和心理健康，为社会和家庭增加负担，因此如何防治OP成为亟待解决的问题。

自噬是一种在所有真核生物细胞中普遍存在的、进化上保守的过程，具有许多生理功能。自噬可更新长寿命蛋白，去除多余或受损的细胞器；针对多种胁迫条件(如营养限制、热以及氧化胁迫)产生细胞应答而被诱导。在细胞的发育和分化中发挥作用。越来越多证据表明自噬参与维持骨代谢平衡，在OP的发病机制及防治中起到重要作用。

一、自噬参与骨质疏松症发病机制

自噬参与多种类型的OP的发病机制。Rinaldo等[1]总结了自噬途径的失调与OP之间的可能关系：衰老、长期使用糖皮质激素(glucocorticoid，GC)和雌激素缺乏可增加骨组织氧化应激，诱导成骨细胞(osteoblast，OB)和骨细胞凋亡，并增加破骨细胞(osteoclast，OC)的骨吸收，从而导致骨丢失。另一方面，氧化应激增加刺激自噬途径，通过降解受损的蛋白质和细胞器，减少细胞应激，抑制OB和骨细胞凋亡，减轻骨丢失和OP。衰老引起的自噬减少会导致氧化应激增加。雌激素缺乏和氧化应激引起的自噬增加活化OC，而导致骨丢失和随后的OP。

1.自噬与绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)：OP常见于绝经后妇女，由于机体卵巢功能减退和雌激素水平下降，影响骨骼细胞活性并导致骨丢失，是常见的OP类型。PMOP与自噬关系密切，研究表明，卵巢切除大鼠的自噬水平减弱，但过表达的损伤调节自噬因子可能会增加OB的自噬水平，抑制增殖并诱导凋亡。雌激素具有增强OB线粒体自噬活性的功能，骨细胞区microRNA通过胰岛素样生长因子1/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路参与雌激素提高骨细胞自噬活动。激活自噬能够增加骨量，减少骨髓腔内脂肪组织形成，增强骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchy-mal stem cells，BMMSCs)成骨分化而减弱其成脂分化[2]。但也有研究得到了相反的结论，认为卵巢切除大鼠体内自噬水平升高，雌激素可逆转升高的自噬水平，通过调控GPER影响PI3K/Akt/ mTOR信号通路抑制OB和软骨细胞线粒体自噬[3]。

2.自噬与老年性骨质疏松症(senile osteoporosis，SOP)：SOP是增龄等综合因素导致的一种以骨量低下，骨微结构损坏，骨脆性增加，容易发生骨折为特征的全身性骨病。研究发现，衰老小鼠自噬能力下降可诱发SOP，自噬诱导剂雷帕霉素通过促进OB功能活动，减少OC数量并抑制OC活动，抑制骨细胞凋亡，促进骨细胞自噬，对SOP起到了明显的骨保护作用。氧化应激与SOP关系密切，随年龄增长，氧化应激水平升高，抗氧化能力减弱，骨量减少，激活自噬能降低BMMSCs细胞的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，抑制自噬能提高BMMSCs细胞的ROS水平，调节自噬可影响细胞周期和细胞凋亡，并恢复大鼠骨丢失[2]。

3.自噬与糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)：研究表明，GC可诱导骨组织中BMMSCs、OB、OC、骨细胞自噬，发挥骨保护作用。而高浓度GC损害了BMMSCs的增殖，诱发自噬，使用自噬抑制剂3-MA后进一步抑制BMMSCs的增殖并促进其凋亡，表明自噬能够维持其增殖活力并抑制高浓度GC造成的凋亡，在GC刺激的应激环境下保护细胞。在OB中GC以剂量依赖的方式调节自噬，随着时间的推移，自噬水平在48h达到峰值，然后逐渐下降。GC诱导OB凋亡，抑制OB基因的表达，抑制自噬可进一步促进细胞凋亡和抑制基因表达，自噬通过与Bax/Bcl-2的相互作用是OB凋亡的重要调节因子。地塞米松可能通过抑制Akt/mTOR信号通路、调节ROS/SIRT1/FOXO3通路诱导OB或OC自噬来发挥其在GIOP中的保护作用[4]。

4.自噬与糖尿病性骨质疏松症：研究表明，糖尿病抑制OB骨形成作用强于抑制OC骨吸收作用，减少大鼠骨形成，降低骨密度。高糖环境BMMSCs细胞微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)Ⅱ表达增加，自噬水平升高，并通过介导Wnt/β-catenin通路中的相关因子表达加强对衰老细胞的吞噬作用并提高其成骨分化的能力。高糖环境抑制OB可能与细胞内氧化应激水平升高、线粒体损伤和自噬有关，通过ROS-Akt-mTOR轴及ERK/p38MAPK通路影响OB自噬，进而影响其增殖和凋亡。高糖环境影响OC是通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路抑制OC形成过程中的自噬，减弱OC的形成与功能[2]。

二、调节自噬防治OP的中药及复方研究

OB和OC来源具有同一性，其间存在生克制化关系，阳性、阴性调控因子以及阴阳属性的相对性。吴克亮等[5]研究认为，OB及其主导的骨生成属于“阴”，OC及其主导的骨吸收属于“阳”，二者动态平衡发挥维持骨稳态的作用，二者失衡造成的骨稳态破坏是OP的基本病理改变。从微观层面来说，自噬利于细胞生存的作用为“阳”，诱导细胞死亡的作用为“阴”，细胞通过自噬降解属性为“阴”的无用的细胞器、蛋白质等代谢产物，化生属性为“阳”的新的分子元素为细胞提供能量，实现物质和能量的更新，阴阳此消彼长，达到平衡。若自噬过度，则过快过多地分解代谢产物，造成细胞损伤。若自噬不足，则代谢产物堆积，再循环利用能量不足，不利于细胞生成与存活。这与OP中骨稳态失衡的病理状态相契合。目前中药基于自噬防治OP的作用机制研究以单味药为主。

1.单味药研究

(1)补阳药：肾藏精，主骨生髓，基于中医理论，肾虚精亏是导致OP的主要病机，故临床主要采用补肾法治疗。淫羊藿、巴戟天、仙茅具有补肾阳、强筋骨之功效。淫羊藿主要成分淫羊藿苷能够改善卵巢切除所致PMOP大鼠骨微结构，上调自噬相关蛋白的表达。增强BMMSCs成骨和矿化能力，上调成骨相关蛋白BMP2、RUNX2和自噬相关蛋白LC3的表达，下调p62蛋白的表达。改善自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤引起的骨小梁数目减少、骨小梁厚度和骨皮质变薄的加剧[6]。体外研究中，淫羊藿苷能增加小鼠前体成骨细胞株(MC3T3-E1)自噬体的数量，上调成骨分化标志物collagen Ⅰ、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、骨钙素(osteocalcin，OCN)、Runx2及自噬相关基因ULK1、FIP200、ATG13的mRNA和蛋白的表达；提取7～10天龄的SD雄性大鼠膝关节软骨细胞，淫羊藿苷通过下调NF-κB信号通路减弱肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α诱导的软骨细胞凋亡，激活自噬过程[7]。仙茅有效成分仙茅苷可在用游离铁螯合剂去铁胺处理的铁超载OB细胞中抑制抗氧化酶上游蛋白FOXO1磷酸化，升高FOXO1，从而升高其下游蛋白抗氧化酶和自噬相关蛋白LC3B水平，促进OB自噬，抑制铁超载引起的OB的氧化损伤，增强OB骨形成的作用[8]。巴戟天有效成分水晶兰苷通过Akt/mTOR通路增强自噬介导抗氧化作用，保护氧化应激暴露中的OB[9]。

(2)补气药:人参可大补脾脏、肾脏、心脏、肺之气，其有效成分人参皂苷Rb2能抑制去势小鼠NF-κB信号通路和调控mTOR介导的自噬信号通路抑制OC形成和分化[10]。甘草具有补脾益气之效，在体外培养的RAW 264.7细胞以及体内腹腔注射中，发现其有效成分异甘草素可阻断NF-κB通路下调自噬，从而抑制体外OC分化和体内OC形成和炎性骨吸收[11]。红景天具有益气活血之效，其有效成分红景天苷能在PMOP患者中通过调控缺氧诱导因子1α多肽(hypoxia-inducible factor 1-α，HIF-1α)介导的自噬从而抵抗骨细胞凋亡，拮抗氧化应激改善OP[12]。

(3)活血化瘀药：川芎具有活血行气、祛风止痛的功效，其有效成分川芎嗪能够通过AMPK/mTOR途径诱导自噬从而保护高GC刺激的成骨分化的抑制和BMMSCs的凋亡[2]。牛膝具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨的功效，其有效成分牛膝甾酮在体外可通过上调成骨分化相关基因collagenⅠ、OPG、OPN、OCN的表达及刺激自噬体的形成从而促进OB分化。β-蜕皮甾酮可下调GIOP大鼠中自噬相关蛋白Beclin1、ATG5、LC3Ⅰ/Ⅱ和凋亡[13, 14]。

(4)清热药：穿心莲具有清热解毒凉血、消肿、燥湿的功效，其有效成分穿心莲内酯在体外能够通过抑制TNF-α激活的自噬相关NF-κB通路保护和促进BMMSCs成骨分化；通过抑制NF-κB通路的活化还可抑制OC分化，从而抑制骨丢失；通过调控ERK通路促进OB增殖、激活Wnt/β-catenin 促进成骨分化，从而增加骨合成[15]。知母具有清热泻火、滋阴润燥的功效，其有效成分芒果苷可在由叔丁基过氧化氢构建的软骨细胞损伤模型中通过激活AMPK信号通路增加软骨细胞自噬并减少凋亡[16]。苦参具有清热燥湿、杀虫利尿的功效，其有效成分苦参碱可通过调控NF-κB/AKT/MAPK通路，抑制破骨细胞生成，抑制炎性反应，减轻卵巢切除小鼠OP症状[17]。

2.中药化学成分研究

白藜芦醇是一类天然多酚化合物，来源于虎杖、葡萄等多种植物，表现出多种活性。白藜芦醇能增强GIOP大鼠模型SIRT1活性，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，促进OB自噬，影响RAW 264.7细胞自噬而抑制OC分化，诱导由H2O2构建的OB和软骨细胞氧化应激状态下的自噬，以降低氧化应激水平，保护OB存活，抑制软骨细胞增生[18]。

黄酮类成分槲皮素通过上调自噬相关基因LC3和Beclin1和凋亡相关基因caspase-3的表达，下调凋亡相关基因Bcl-2的表达，减轻雌激素缺乏诱导的OP[19]。山奈酚是一种广泛存在于各种植物中的膳食生物类黄酮，对新生大鼠、GC诱导的OP模型、卵巢切除诱导的OP模型和骨折模型均有保骨作用，通过抑制脂肪生成、炎症、氧化应激、破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡，激活成骨细胞自噬，达到骨保护作用，自噬通路MAPK、mTOR参与其抗OP作用[18]。此外，一些黄酮类成分如高良姜素、淫羊藿苷Ⅱ、芦丁等通过调控自噬以保护BMMSCs的生存并促进成骨细胞的分化[2]。

欧前胡素来源于白芷、防风等植物，可通过提高自噬水平恢复去势大鼠BMMSCs向成骨分化的能力，治疗PMOP[20]。鸢尾素可降低自噬底物p62水平，升高LC3B水平，通过激活自噬促进体外培养的老龄小鼠BMMSCs骨向分化的能力[21]。防己有效成分防己诺林碱可通过提高自噬相关蛋白ATG5和Beclin1增加自噬来预防GC诱导的OP大鼠骨质流失[22]。葛根的有效成分葛根素可通过激活AMPK/LC3信号通路或下调miR-204表达致LC3B表达增加上调自噬增强OB增殖和分化，还可通过Akt/mTOR通路诱导OC自噬。脱氢木香内酯通过下调整合素β3、蛋白激酶C-β和ATG5表达，抑制破骨细胞的迁移和溶酶体生物发生和分泌，从而抑制破骨细胞的活化[2]。香豆素衍生物蛇床子素在雌激素缺乏诱导的OP模型中通过上调自噬相关基因Beclin1和LC3的mRNA和蛋白表达水平诱导自噬，促进BMMSCs成骨分化[23]。此外，紫丁香苷通过上调LC3Ⅱ的表达诱导自噬促进成骨分化。益母草碱通过PI3K/Akt/mTOR通路激活自噬促进大鼠BMMSCs向成骨细胞分化。熊果苷通过上调地塞米松引起的自噬抑制改善小鼠GIOP。

3.中药复方研究

(1)补肾壮骨方药:二至丸(墨旱莲、女贞子)可降低自噬相关基因mTOR、ATG5、Beclin1、p62表达从而抑制OC分化来改善GC所致的斑马鱼OP症状[24]。左归丸和右归丸(熟地黄、炒山药、枸杞子、山茱萸等)均可升高去卵巢大鼠BMMSCs自噬水平[4]。滋阴补肾方(生龙骨、生牡蛎、桑寄生、续断、淫羊藿、天花粉、黄连)通过上调Wnt/β-catenin信号通路显著增加OB数量，增加骨量，治疗糖尿病合并去卵巢OP大鼠[25]。

(2)补肾健脾方药：培本固疏方(人参、鹿角片、龟板、仙桃草等)通过抑制卵巢切除OP大鼠自噬相关NF-κB通路抑制OC分化和成熟，并减少机体晚期糖基化终末产物的堆积抗氧化应激，进一步减少NF-κB的表达，从而增加骨密度，提高骨强度，改善骨代谢[26]。续苓健骨方(川续断、白术、陈皮、赤芍、红花、甘草等)治疗卵巢切除所致大鼠OP模型过程中筛选差异miRNA的表达，发现自噬通路参与其作用[27]。

(3)补肾活血方药：补正续骨丸(何首乌、自然铜、骨碎补、续断等)通过调节自噬相关mTOR1信号通路糖体蛋白S6激酶1、真核细胞翻译启始因子4E蛋白的表达抑制骨吸收，从而对卵巢切除所致PMOP大鼠模型及OP性骨折有一定防治作用[28]。补肾通络方能够通过降低自噬相关基因ATG5、ATG7A的表达抑制破骨细胞分化，显著改善泼尼松龙诱导的斑马鱼OP症状[29]。

(4)滋补肝肾方药:抗疏强骨合剂(黄芪、熟地黄、淫羊藿、肉苁蓉、菟丝子、当归、丹参、三七、延胡索、白芍、骨碎补、牛膝、甘草)通过降低骨组织中自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的含量，抑制自噬达到治疗去势OP的作用[30]。

三、展 望

OP与中医“骨痹”、“骨痿”症状相似，基于中医“肾主骨”的理论，中医药主要通过补肾的方法防治OP，且能通过整体观念对患者进行综合治疗，结合病证特点进行辨证施治，在防治 OP方面具有其独特优势。但对其治疗机制的研究有待进一步加强，对自噬相关机制的研究更是从近几年才开始的。自噬与中医肾阴阳理论关系密切，在骨代谢以及BMMSCs、OB、OC、骨细胞的增殖、分化、代谢与生理功能行使中有重要的调控作用。自噬的过度或不足都会引起阴阳失衡，打破骨形成和骨吸收之间的平衡，不利于骨稳态和骨代谢，介导OP的发生和发展。但自噬在维持骨稳态过程中发挥正向还是负向的作用未有定论，治疗过程中过度激活或抑制自噬可能对骨代谢产生不利影响，目前临床尚无自噬调控药物用于防治OP的评估，中药的双向调节作用可能会在维持自噬于适度水平的方面发挥作用，进而维持肾中阴阳的平衡以及骨重建平衡，调控自噬可能成为治疗OP的新思路。