基于分子对接筛选药桑中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分

药桑（Morus nigra Linn.）为黑桑种植物药桑的果实，含有黄酮、生物碱、多糖、香豆素、甾体、萜类和挥发油等成分，具有降血糖、降血脂、降血压、抗炎等作用[1]。研究表明[2-4]药桑降血糖作用机制与抑制α-葡萄糖苷酶的活性有关，但其具体活性成分尚未完全明确。近年来，分子对接技术在天然产物中筛选靶标特异性活性成分方面应用广泛[5]，研究表明[6]Autodock vina 要比Autodock 准确度要高，目前α-葡萄糖苷酶抑制剂的体外筛选方法主要有pNPG 法、Caco-2 细胞筛选模型、固化酶筛选模型、以糖类（麦芽糖等）为底物的筛选模型、微孔板筛选模型等，pNPG 法由于筛选过程耗材少，实验过程方便快捷等优势，是目前最常用、最经典的酶抑制剂筛选方法，适用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的初筛[7]。本研究采用分子对接软件Autodock vina 对药桑果、叶、枝中有文献报道的小分子与大分子α-葡萄糖苷酶进行对接,采用pNPG 法进行实验验证，依据其结合能力和活性大小，探究药桑中潜在的α-葡萄糖苷酶的抑制成分，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试药无水乙醇（天津市致远化学试剂有限公司，分析纯），磷酸二氢钾（天津市盛奥化学试剂有限公司，分析纯），碳酸钠（天津市北联精细化学品开发有限公司，分析纯），氢氧化钠（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）。4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，S10137，生物技术级99 %）、α-葡萄糖苷酶（S10050-100 U）、异鼠李素（B21554，HPLC≥98 %）、异槲皮苷（B21527，HPLC≥98 %）、紫云英苷（B21704，HPLC≥98 %）隐绿 原 酸（B21587，HPLC≥98 % ）、阿 卡 波 糖（B20003，HPLC≥98 %）、白藜芦醇（B20044，HPLC≥98 %）、新绿原酸（B20888，HPLC≥98 %）均购于上海源叶生物科技有限公司。 实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器R1001-VN 型旋转蒸发仪、SHB-III A 型循环水式多用真空泵、WB-2000 型水浴锅（郑州长城科工贸有限公司），AB135-S型电子天平（瑞士梅特勒公司），Multiskan GO 全波长酶标仪、DHP-9082 型电热恒温培养箱、雷磁HY-1 型旋涡混匀仪（美国Ther⁃mo Fisher公司）。

1.3 药材药桑叶、果、枝均采于新疆和田地区同一棵桑树，由新疆医科大学中医学院徐海燕副教授鉴定为药桑（Morus nigra Linn.）的叶（Folium Mori）、果（Fructus Mori）、枝（Ramulus Mori）。

1.4 方法

1.4.1 蛋白质结构准备 从蛋白质数据库中（https://www.rcsb.org/pdb）下载结合有α-D-glucose 的α-葡萄糖苷酶（PDB ID 3A4A）的晶体结构，利用Discovery studio 4.5 试用版（DS）软件提取复合物中原配体保存，确定结合位点，设置对接参数conf.txt文件。除去蛋白质中的水与调节溶剂分子，利用Autodock tools（Scripps 研究所的Olson 实验室）[8]为蛋白质加氢、加电荷、设置原子类型，保存为pdbqt 格式备用。

1.4.2 配体分子准备 通过课题组前期研究与查阅文献[9-13]，确定药桑中主要活性成分12 种，其结构见表1 所示，采用ZINC（http://zinc.docking.org/）小分子数据库下载活性成分SDF 格式的3D 结构，并用OpenBabel-2.4.1 化学结构格式转换工具将格式转换为pdbqt格式备用。

表1 12种成分的分子式与结构式

1.4.3 分子对接方法 将配体pdbqt 文件、受体pdbqt文件、对接参数文件conf.txt 和Autodock vina 程序放在一个文件夹内，通过Windows命令程序cmd调用vi⁃na 对接程序进行对接，记录亲和力大小，以临床常用药阿卡波糖的对接结果为阈值，亲和力越小越好，低于阈值视为优秀。为提高筛选的准确性，本研究以亲和力< -7.0 Kcal/mol 为潜在抑制剂筛选条件，最后用PyMOL 1.0（DeLano Scientific LLC 公司）作图，分析受体-配体相互作用。

1.4.4 对接方法学评价[14]将提取出的原配体分子α-D-glucose 对接回受体的结合口袋，通过与原晶体复合物中的配体分子的POSE 进行叠合比对，评价对接方法的准确性。

1.4.5 样品处理与缓冲盐溶液配制 分别将桑叶、桑枝、桑椹，粉碎，过筛，分别称取1 g 粉末，75 %乙醇按料液比1∶25（g/mL），超声提取3 次，每次30 min，过滤，合并滤液，回流浓缩，水浴干燥后取适量粉末配制2 g/L 的溶液。用10 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液（pH 6.86）将α-葡萄糖苷酶冻干粉配制0.5 U/mL的酶溶液。10 mmol/L（pH 6.86）的PBS 磷酸缓冲盐的配制：分别取2.00 g NaOH 和13.60 g KH2PO4溶于250 mL 容量瓶和500 mL 容量瓶，从中分别取118 mL NaOH 溶液和250 mL KH2PO4溶液混合稀释到1 000 mL 容量瓶即得10 mmol/L（pH 6.86）的PBS 磷酸缓冲盐溶液。

续表

1.4.6α-葡萄糖苷酶活性抑制实验 以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-Glucopyran⁃oside，pNPG）为底物，阿卡波糖为阳性对照，分别测定药桑不同药用部位提取物及分子对接部分成分的酶抑制活性。实验分为空白组、样品空白组，样品组和对照组（n＝3）。空白组不加样品和酶，样品空白组不加α-葡萄糖苷酶溶液，对照组不加样品。其余组依次加入PBS 缓冲液、样品和α-葡萄糖苷酶液于96孔板，于37 ℃培养箱中反应15 min，加入10 mmol/L pNPG 溶液，孵育20 min，加入0.2 mol/L 的Na2CO3溶液终止反应，立刻测定405 nm 处吸光度（A）值[15]。按照公式I=1-[(As－Asb)]/(Ac-Ab)]计算其α-葡萄糖苷酶抑制率（I），Ac：对照组；Ab：空白组；As：样品组；Asb：样品空白组。考察0～2.0 g/L 内5个不同质量浓度下各药用部位提取物及部分活性成分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。通过Graphpad Prism 计算IC50，具体滴加溶液量见表2。

表2 各组酶促反应体系（n=3）

2 结果

2.1 方法学评价结果重新对接的配体与原受体结晶中的配体位置比较见图1（A），α-D-glucose 的重新对接构象与原始构象在所选的对接参数下能够较好的叠合，其对接评分为4.92，得分较高，表明所选用的蛋白结构及对接方法比较可靠，可用于虚拟筛选。

图1 原配体对接叠合比较图

2.2 分子对接结果对药桑中已报道的12种小分子和阿卡波糖分别与α-葡萄糖苷酶进行分子对接，对接亲和力结果见表3，发现12种成分的亲和力大小均小于0，且其中11 个化合物亲和力小于阈值（< -5.14 Kcal/mol），其中结合性最好的是1-脱氧野尻霉素，评分为10.49，将评分排名前8 的对接模式作图（亲和力< -7.0 Kcal/mol），见图2，它们与阿卡波糖一样与α-葡萄糖苷酶氨基酸残基Asp 69、Asp 215、Glu 277、Asp 352形成强氢键作用。

图2 1-脱氧野尻霉素

表3 12种药桑成分与α-葡萄糖苷酶的对接结果

2.3 药桑各药用部位提取物的抑制活性将药桑不同药用部位提取物进行α-葡萄糖苷酶活性实验结果见表4 和图3，可以很明显的看出桑不同药用部位提取物有良好的的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并且各药用部位提取物中桑枝活性>桑叶>桑椹。

图3 药桑各药用部位剂量反应曲线图

表4 药桑各药用部位提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n=3）

药用部位提取桑叶桑枝桑椹样品浓度/（μg/mL）800.0 400.0 80.00 50.00 10.00 800.0 400.0 80.00 50.00 10.00 800.0 400.0 80.00 50.00 10.00抑制率/%96.25±0.05 89.42±0.03 75.00±0.54 63.00±1.64 52.00±0.02 96.40±0.05 92.64±0.73 82.00±1.35 74.00±0.03 53.00±0.01 93.09±0.03 83.34±0.01 64.00±0.50 42.00±0.45 38.00±0.65 IC50/（μg/mL）11.100 8.647 37.580

2.4 药桑中部分高活性化合物的抑制活性将表3中打分值较高的成分异鼠李素、异槲皮苷、紫云英苷、隐绿原酸、阿卡波糖、白藜芦醇、新绿原酸进行活性验证，计算其IC50值。结果见表5，各样品都表现出不错的结合活性，并且呈现明显的剂量依赖性，其中异槲皮苷活性>白藜芦醇>异鼠李素>紫云英苷>隐绿原酸，并且异鼠李素与紫云英苷的IC50值接近，其中阿卡波糖活性最好，IC50为1.92×10-4μg/mL。

表5 部分活性成分对α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n=3）

组别阿卡波糖异槲皮苷异鼠李素紫云英苷隐绿原酸白藜芦醇样品浓度/（μg/mL）0.001 0.005 0.010 0.050 0.100 120.0 160.0 200.0 240.0 280.0 120.0 160.0 200.0 240.0 280.0 120.0 160.0 200.0 400.0 600.0 160.0 200.0 400.0 600.0 800.0 400.0 800.0 1200 1600 2000抑制率/%72.53±0.23 85.31±0.15 92.53±0.21 95.21±0.06 98.32±0.13 21.59±0.21 43.08±0.82 45.37±0.64 53.24±0.29 58.36±0.31 14.64±1.20 20.16±0.10 42.44±1.51 54.46±0.08 59.66±0.07 10.24±0.24 11.71±0.54 28.75±0.64 59.62±0.15 69.23±0.13 18.22±0.54 23.53±0.06 39.89±0.09 45.55±0.15 66.82±0.02 56.04±0.15 60.36±0.15 66.52±0.14 69.76±0.45 80.19±0.06 IC50/（μg/mL）1.92×10-4 220.7 353.2 355.4 556.0 312.9

3 讨论

本研究应用分子对接技术发现药桑中12 种成分对α-葡萄糖苷酶（3A4A）亲和力大小均小于0，且其中11 种成分亲和力小于阿卡波糖亲和力阈值（<-5.14 Kcal/mol）。此外，1-脱氧野尻霉素、异槲皮苷、荞麦碱、白藜芦醇、异鼠李素、紫云英苷、槲皮素、隐绿原酸与α-葡萄糖苷酶的结合活性较高（亲和力< -7.0 Kcal/mol），这8 种成分与阿卡波糖皆与α-葡萄糖苷酶氨基酸残基Asp 69、Asp 215、Glu 277、Asp 352形成强氢键作用，这可能是它们对α-葡萄糖苷酶的形成强抑制作用的主要作用力。活性验证实验表明其中5 种得分值高的成分具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并且异槲皮苷活性>白藜芦醇>异鼠李素>紫云英苷>隐绿原酸，表明分子对接筛选酶抑制剂具有一定的准确性。

Chen 等[16]研究发现桑树不同药用部位中黄酮（Morin、sanggenon C、kuwanon G 和morusin）、黄酮醇（山奈酚、槲皮素、芦丁和异槲皮苷）和生物碱（1-脱氧野尻霉素）是α-葡萄糖苷酶的抑制成分，与本研究部分化合物一致，并且本研究采用pNPG 法证实了药桑各药用部位醇提物活性高于部分单体化合物，且各药用部位提取物中桑枝活性>桑叶>桑椹，本研究还发现白藜芦醇、异鼠李素、紫云英苷、隐绿原酸也是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，进一步扩大了药桑资源活性成分范围。此外，这8种成分在体内也具有多种降糖活性，如改善胰岛素抵抗[17]，保护胰岛β 细胞等功效[18-19]，其具有多靶点多通路治疗糖尿病的作用。因此，通过分子对接进行α-葡萄糖苷酶抑制剂的体外筛选是可行且高效的。本研究应用分子对接原理筛选到8 种具有潜在α-葡萄糖苷酶抑制活性成分，为药桑通过抑制α-葡萄糖苷酶抗糖尿病的物质基础做了新的补充，为从天然产物中筛选活性成分提供了新的技术参考。