ACAT1基因多态性与冠心病的关联研究

王永涛，魏 娴，刘 成，黄 定，付真彦，马依彤

（新疆医科大学第一附属医院心脏中心,乌鲁木齐830054）

心脑血管疾病是世界范围内排名首位的致死性疾病，其中尤以冠心病对人类健康的危害最大，全世界约五分之一的死亡与冠心病相关[1-2]。目前研究显示，冠心病是由环境因素和多种遗传变异共同导致的复杂性疾病，既往流行病学及双胞胎研究结果显示，冠心病的遗传率可达40%～60%，提示冠心病具有明显的遗传倾向[3-4]。酯酰辅酶A 胆固醇酯酰转移酶A（ACAT）是细胞内唯一能够合成胆固醇酯的酶，在细胞和体内胆固醇代谢平衡中发挥重要功能[5-6]。ACAT 有两种同工酶即ACAT1 和ACAT2。ACAT1 广泛存在于人体内各种组织和细胞中，其可将游离胆固醇催化为胆固醇酯（CEs），从而在哺乳动物细胞胆固醇稳态中发挥重要作用[7-8]。既往研究已证明，进入内皮下的单核和巨噬细胞，在高活性或高表达的ACAT1 的作用下，形成并积聚大量的胆固醇酯，从而形成动脉内皮下泡沫细胞，这是动脉粥样硬化的早期病理过程[9-10]。目前关于ACAT1 基因多态性与冠心病的关联研究较少，Wu 等[11]进行的病例对照研究结果显示，ACAT1 基因rs1044925 位点与冠心病的发生显著相关，携带C等位基因者患冠心病的风险显著增加。 本研究采用病例对照的研究方法，探讨ACAT1 基 因rs1044925、rs11545566、rs12121758 及rs10913733位点多态性与冠心病发生的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2017 年1 月-2018 年12 月在新疆医科大学第一附属医院心脏中心住院，经冠脉造影确诊的冠心病患者300例(冠心病组)和冠脉造影正常的健康对照者300例（对照组）为研究对象，所有患者入组前均签署知情同意书,通过医院伦理委员会批准（伦理审批号：20190505-01）。按照纳入标准和排除标准纳入冠心病组和对照组。

1.2 纳入和排除标准冠心病组纳入标准：按照世界卫生组织制定的缺血性心脏病的诊断标准，选择完善冠状动脉造影提示有一支或多支血管狭窄程度≥50% 的患者。冠心病组排除标准：临床资料不全的患者以及同时合并精神障碍不能配合者、恶性肿瘤患者、心源性休克、先天性心脏病者、主动脉夹层、风湿性心脏病、以及多脏器功能衰竭的患者均予以剔除。对照组纳入标准：（1）筛选与冠心病组民族、年龄、性别均匹配的同期住院患者；（2）冠状动脉造影完全正常。对照组排除标准：经多普勒检查证实有颈动脉斑块或狭窄者或有冠心病、心源性休克、先天性心脏病、严重心律失常、恶性肿瘤心力衰竭、有支架植入及心脏搭桥病史者、服用降血脂药物者或各类检查结果不全者均予以剔除。

1.3 临床资料的收集由新疆医科大学第一附属医院冠心病重点实验室专业研究人员进行资料的收集工作，收集的资料包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、血压、身高、体重、现病史、既往史、用药史等。

1.4 采集血样及临床指标的测定严格按照血液标本采集的要求进行采血，于患者空腹8～12 h 后收集血液。于肘静脉处采集外周静脉血10 mL，分别分装于K3EDTA抗凝真空采血管和普通生化采血管，用于血液生化指标和提取DNA。由新疆医科大学第一附属医院检验中心采用美国雅培C16000系统生化免疫仪，对总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、血糖等指标进行检测。

1.5 DNA的提取及基因型检测DNA抽提由新疆医科大学第一附属医院心血管病研究重点实验室专业实验人员使用DNA 提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），按照说明书步骤提取外周静脉血DNA，置于-20℃冰箱保存待用。利用Haploview 4.2软件，以中国汉族人群为参照（MAF）≥10%，r2>0.8，使用国际人类基因组单体型图计划网站来分析并且确定ACAT1 基因的标签SNPs，最终选择了ACAT1 基因的rs1044925、rs11545566、rs12121758 及rs10913733位点进行研究。采用改良多重连接酶反应(improved multiple ligase detection reaction,iMLDR)技术测定基因多态性[12]，引物序列见表1所示。

表1 ACAT1基因鉴定引物序列

1.6 统计学方法使用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。计量资料用（±s）表示，两组间比较采用t检验，偏态分布的计量资料用中位数（四分位数间距）表示，两组间比较采用秩和检验；计数资料用n（%）表示，两组间比较采用卡方检验；基因多态性与冠心病的关联性分析采用非条件Logistic回归模型进行分析，按照Lewis 2002 年提出的概念定义显性模型、隐性模型和相加模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组人群一般资料比较冠心病组和对照组的年龄及性别比较无统计学差异，说明两组人群具有较好的匹配性。冠心病组和对照组在饮酒史、体质指数、TG、HDL-C水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。冠心病组TC、LDL-C 水平及高血压、糖尿病、吸烟史所占比例均明显高于对照组（P<0.05），见表2。

表2 冠心病组及对照组人群一般资料比较

2.2 冠心病组及对照组ACAT1 基因型分布频率比较及多因素分析基因型分析结果显示，rs1044925位点以AA 型为主，两组间基因型、显性模型、隐形模型、相加模型分布差异均无统计学意义（P均>0.05）。rs11545566位点以GA型为主，两组间基因型、显性模型的分布差异具有统计学意义（P=0.007，P=0.002）；多因素分析显示在调整了年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压、糖尿病、TC、TG、HDL-C、LDL-C 等混杂因素后，携带GA 基因型及GG 基因型者患冠心病的风险分别是AA 基因型携带者的2.033 倍、2.091 倍（P=0.004，P=0.005），显性模型中携带GA 和GG 基因型者患冠心病的风险是AA 基因型携带者的2.057 倍（P=0.002）；rs12121758 位点以AC 型为主，两组间基因型、显性模型、隐性模型的分布差异具有统计学意义（P=0.016，P=0.010,P=0.041）。rs10913733位点以GT型为主，两组间基因型、显性模型、隐性模型的分布差异具有统计学意义（P=0.021，P=0.023,P=0.022）；调整了混杂因素后，rs12121758 和rs10913733 位点基因型、显性模型、隐性模型在两组间差异均无统计学意义（P>0.05），见表3。

表3 冠心病组及对照组ACAT1基因型分布频率比较及多因素分析

2.3 ACAT1 基因多态性与冠心病关联性的分层分析以性别、吸烟史、高血压、糖尿病作为分层因素，分层评价ACAT1 基因rs1044925、rs11545566、rs12121758 及rs10913733 位点与冠心病的关联性。结果显示，rs11545566 位点GA+GG 基因型在女性组、不吸烟组、高血压组、糖尿病组及非糖尿病组中均显著增加了发生冠心病的风险（P均<0.05），而rs1044925 、rs12121758 及rs10913733 位点在各个分层中均未发现统计学差异（P均>0.05），见表4。

表4 ACAT1基因多态性与冠心病关联性的分层分析

3 讨论

人类ACAT1 基因的编码区位于1q25，由18 个外显子组成[13-14]。早期研究发现，ACAT-1 是一种完整的膜蛋白，可将游离胆固醇转化为CEs 的储存形式，ACAT1 基因表达缺失将增加小鼠巨噬细胞中游离胆固醇的合成和流出，而过表达ACAT1 基因可促进胆固醇酯的累积以及巨噬细胞来源的泡沫细胞的形成，因此大量研究人员认为，ACAT1 基因可以控制细胞游离胆固醇和胆固醇酯的比例，进而影响动脉粥样硬化过程的发生发展[15-16]。然而，ACAT1 在动脉粥样硬化中的作用目前在不同的研究中并不一致。在动脉粥样硬化小鼠模型中进行的实验显示，ACAT1抑制剂F-1394 对ACAT1 的抑制作用可明显减少早期动脉粥样硬化的发展，而ACAT1 抑制剂CS-505 通过降低胆固醇水平及其产生的直接损伤作用，不仅可以减少而且可以稳定动脉粥样硬化斑块[17-18]。上述研究均表明ACAT1 过表达可能导致动脉粥样硬化的发生，而ACAT1 抑制剂可能在动脉粥样硬化的临床治疗中发挥有益作用。然而也有一些动物实验的研究结果显示，ACAT1 抑制剂可加速动脉粥硬化的发展。研究者在LDLR 敲除(LDLR(-/-))小鼠高胆固醇血症模型中进行实验，结果显示与对照组相比，ACAT1 抑制剂组动脉粥样硬化更为明显，而在巨噬细胞中ACAT1 的表达缺失将加速高胆固醇血症apoE-/-小鼠的动脉粥样硬化[18-19]。造成上述情况可能是由于ACAT1 表达缺失后游离胆固醇水平增加，进而引起的细胞毒性所致。

近年来关于ACAT1 基因多态性的研究多集中在阿尔茨海默病和血脂异常方面，关于ACAT1 基因多态性与冠心病的关联研究较少。既往研究结果显示，ACAT1 基因rs1044925 位点多态性与与阿尔茨海默病的发生具有显著相关性，C 等位基因携带者患阿尔茨海默病的风险显著增加[20]。Wu 等[11]的研究也显示，中国男性高脂血症人群中，ACAT1基因rs1044925位点C 等位基因携带者较A 等位基因者HDL-C 水平明显升高。上述结果表明，ACAT1 基因在多种疾病中发挥重要作用。为进一步明确ACAT1 基因多态性与冠心病的关联性，本研究检测了ACAT1 基因rs1044925、rs11545566、rs12121758 及rs10913733 位点的多态性，结果发现冠心病组与对照组间rs11545566、rs12121758 及rs10913733 位点基因型、显性模型分布差异具有统计学意义，而在多因素分析中，调整了年龄、性别、吸烟史、饮酒史、高血压、糖尿病、TC、TG、HDL-C、LDL-C 等混杂因素后，发现rs11545566 位点GA 和GG 基因型是发生冠心病的独立危险因素，其可能的机制是rs11545566位点可能通过调控ACAT1 蛋白及相关因子水平进而影响细胞和体内胆固醇代谢平衡，最终导致冠心病的发生。

综上所述，ACAT1 基因在冠心病的发生、发展过程中可能起重要作用。ACAT1 基因rs11545566 位点GA 及GG 基因型携带者患冠心病的风险显著增加，提示ACAT1 基因rs11545566 位点可作为冠心病的潜在生物标记物。