miR-412-5p靶向PCDH10对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

刘江帆，魏丹丹，李朝红

(河南省直第三人民医院 呼吸与危重症医学科，河南 郑州450000)

肺癌是最常见的癌症之一[1-2]。微小RNA(MicroRNA，miRNA/miR)是一类长度约为22个核苷酸的短链非编码RNA，参与细胞周期、增殖、凋亡等不同的细胞生理过程[3]。越来越多的证据表明，miRNA在癌细胞中异常表达，被认为是治疗癌症的潜在靶点/药物，包括肺癌[4]。有学者对肺癌中差异表达的miRNA进行筛选发现，miR-412-5p在肺癌中高表达，且发现miR-412-5p在肺癌中上调，表达量约为正常组织的4倍[5-6]，原钙黏蛋白10(PCDH10)基因位于人类染色体4q28.3上，是一种肿瘤抑制基因，在多种恶性肿瘤中下调表达[7]，研究发现PCDH10在肺癌中低表达，过表达PCDH10对细胞增殖、迁移、侵袭具有抑制作用[8]，但miR-412-5p与PCDH10靶向关系尚未可知，本研究以肺癌细胞A549为实验对象，考察miR-412-5p对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

肺癌细胞A549购自中科院上海细胞库，RPMI-1640培养基(Roswell Park Memorial Institute)、胎牛血清购自Gibco公司，Trizol、Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，PCDH10(货号ab172709)、基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloprotease-2，MMP-2)(货号ab86607)购自Abcam公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(货号51332)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(货号2978)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)(货号14472)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗(货号bs-40296G-HRP)购自北京博奥森生物技术有限公司，miR-412-5p、anti-miR-412-5p、si-PCDH10及各自阴性对照购自上海GenePharma公司，RIPA裂解液、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 临床组织标本

46例肺癌组织及癌旁组织来源于河南省直第三人民医院因肺癌而接受手术治疗的患者。患者手术前未接受过任何放、化疗的治疗。实验前获得每位患者的知情同意书，经医院伦理委员会批准通过。其中，癌旁组织为距离肺癌组织边缘≥3 cm的正常组织。获得样本后立即置于液氮中保存备用。

1.3 细胞培养

A549细胞加入RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)，放在37℃、5% CO2的培养箱中孵育。细胞生长至80%左右时进行接种传代。

1.4 实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-412-5p表达

使用TRIzol试剂提取组织中总RNA，逆转录成cDNA，以制成的cDNA为模板，进行qPCR反应。miR-412-5p正向引物序列为5’-GGTACGGGGATGGATGGTC-3’，反向引物序列为5’-GGATACGGACGGCTAGTGGA-3’。内参U6正向引物序列为5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物序列为5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。反应结束后，收集Ct值，根据2-ΔΔCt法计算miR-412-5p表达。

1.5 免疫组化实验

收集肺癌组织及癌旁组织标本，用石蜡包埋切片，利用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)试剂盒进行染色，加入一抗4℃孵育过夜、二抗常温孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，显微镜下观察PCDH10蛋白表达并拍照。

1.6 蛋白质印迹法(Western blot)检测PCDH10、Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin蛋白表达

使用RIPA裂解液提取组织中的蛋白，测定蛋白含量后，吸取20 μg蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，将分离的蛋白转移至聚偏氟乙烯膜，加入5%脱脂牛奶封闭，之后加入1∶1 000稀释的PCDH10、Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin蛋白一抗，同时加入1:1 000稀释的GAPDH抗体作为内参照，并于4℃孵育过夜，第2天用Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(TBST)充分漂洗，之后加入1∶5 000稀释的二抗，孵育1 h，曝光、显色，分析PCDH10蛋白表达。

1.7 细胞转染

收集生长状态良好的A549细胞，接种于6孔细胞板，细胞生长至70%左右时，按照Lipofectamine 2000试剂说明书，分别将miR-412-5p、anti-miR-412-5p、si-PCDH10及各自阴性对照转染入A549细胞。转染48 h后，依照1.4和1.5中的方法检测miR-412-5p和PCDH10、Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin蛋白表达。

1.8 噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖

将1×104个/mL密度的A549细胞(转染后)接种于96孔板，分别培养24 h、48 h、72 h，加入MTT溶液100 μL，孵育4 h，之后加入二甲基亚砜200 μL，摇床震荡培养10 min，置酶标仪读取A549细胞490 nm波长处的吸光(OD)值，计算细胞增殖抑制率。

细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.9 Transwell检测细胞迁移和侵袭

Transwell检测转染后的A549细胞迁移，用无血清培养基调整A549细胞密度为5×104个/mL，在上室加入200 μL。下室加入包含血清的培养基。孵育24 h，显微镜下拍照，并记录迁移细胞数。Transwell检测转染后的A549细胞侵袭时，将无血清培养基与Matrigel基质胶混匀，并加入上室，静置3-4 h，其余步骤同细胞迁移检测。

1.10 生物信息学预测和双荧光素酶活性检测

利用starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)工具预测miR-412-5p的靶基因，发现PCDH10的3’非编码区域(3’UTR)含有miR-412-5p的互补序列。分别构建包含miR-412-5p结合位点的野生型PCDH10-3’UTR(WT-PCDH10)或突变型(MUT-PCDH10)报告基因质粒，将其与miR-412-5p或miR-NC共转染。48 h根据双荧光素酶活性检测试剂盒的指示，进行荧光素酶活性测定。

1.11 统计学分析

2 结果

2.1 miR-412-5p、PCDH10在肺癌和癌旁组织中的表达

qPCR检测结果表明，与癌旁组织组比较，肺癌组织中miR-412-5p表达量明显增加(P<0.05，图1A)。Western blot和免疫组化检测结果显示，与癌旁组织组比较，肺癌组织中PCDH10蛋白表达量显著减少(P<0.05，图1B、图1C)。

图1 miR-412-5p、PCDH10在肺癌和癌旁组织中的表达A：miR-412-5p的表达 B：PCDH10蛋白的表达 C:免疫组化染色图注：与癌旁组织组比较，*P<0.05

2.2 抑制miR-412-5p对细胞A549增殖、迁移、侵袭的影响

在肺癌A549细胞中转染anti-miR-412-5p，发现miR-412-5p表达量远远低于anti-miR-NC组(P<0.05，图2A)，提示成功构建抑制miR-412-5p的A549细胞。Transwell检测结果发现，抑制miR-412-5p较anti-miR-NC组显著降低细胞A549迁移细胞数和侵袭细胞数(P<0.05，图2B、图2C)。MTT检测数据表明，与anti-miR-NC组比较，抑制miR-412-5p显著提高24 h、48 h、72 h的细胞增殖抑制率(P<0.05，图2D)。Western blot检测结果显示，与anti-miR-NC组比较，抑制miR-412-5p明显减少Cyclin D1、MMP-2蛋白表达量，而提高E-cadherin蛋白水平(P<0.05，图2E、图2F)。

图2 抑制miR-412-5p对细胞A549增殖、迁移、侵袭的影响A：miR-412-5p的表达 B、C：抑制miR-412-5p对细胞A549迁移、侵袭细胞数的影响 D：抑制miR-412-5p对细胞A549抑制率的影响E、F：抑制miR-412-5p对细胞A549增殖、迁移、侵袭蛋白表达的影响注：与anti-miR-NC组比较，*P<0.05

2.3 miR-412-5p靶向、调控PCDH10

Starbase软件预测结果发现，PCDH10的3’UTR含有miR-412-5p互补的核苷酸序列(图3A)。双荧光素酶报告实验结果表明，与miR-NC组比较，miR-412-5p明显降低WT-PCDH10的荧光素酶相对活性(P<0.05)，而对MUT-PCDH10的荧光素酶相对活性无明显影响(图3B)。与miR-NC组比较，miR-412-5p显著减少PCDH10蛋白表达量；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-412-5p明显提高PCDH10蛋白水平(P<0.05，图3C、图3D)。

图3 miR-412-5p靶向、调控PCDH10A：PCDH10的3’UTR含有miR-412-5p互补的序列 B：双荧光素酶报告实验 C、D：miR-412-5p调控PCDH10的表达注：与miR-NC组比较，*P<0.05；与anti-miR-NC组比较，#P<0.05

2.4 抑制PCDH10能逆转抑制miR-412-5p对细胞A549增殖的影响

与anti-miR-NC组比较，抑制miR-412-5p显著提高A549细胞24 h、48 h、72 h的细胞增殖抑制率(P<0.05，图4A),明显提高PCDH10蛋白水平而减少Cyclin D1表达量(P<0.05，图4B、图4C)。

与anti-miR-412-5p和si-NC共转染组比较，anti-miR-412-5p和si-PCDH10共转染明显降低A549细胞24 h、48 h、72 h的细胞增殖抑制率(P<0.05，图4A)，明显降低PCDH10蛋白水平及增加Cyclin D1表达量(P<0.05，图4B、图4C)。

2.5 抑制PCDH10能逆转抑制miR-412-5p对细胞A549迁移、侵袭的影响

与anti-miR-NC组比较，抑制miR-412-5p显著减少迁移细胞数和侵袭细胞数(P<0.05，图5A、图5B)，明显提高E-cadherin蛋白水平并减少MMP-2表达量(P<0.05，图5C、图5D)。与anti-miR-412-5p和si-NC共转染组比较，anti-miR-412-5p和si-PCDH10共转染明显增加迁移细胞数和侵袭细胞数(P<0.05，图5A、图5B)，显著降低E-cadherin蛋白水平及增加MMP-2表达量(P<0.05，图5C、图5D)。

图4 抑制PCDH10能逆转抑制miR-412-5p对细胞A549增殖蛋白表达的影响A：抑制PCDH10能逆转抑制miR-412-5p对细胞A549抑制率的影响 B、C：抑制PCDH10能逆转抑制miR-412-5p对细胞A549中PCDH10和增殖蛋白表达的影响注：与anti-miR-NC组比较，*P<0.05；与anti-miR-412-5p+si-NC组比较，#P<0.05

图5 抑制PCDH10能逆转抑制miR-412-5p对细胞A549迁移、侵袭及其蛋白表达的影响A、B：抑制PCDH10能逆转抑制miR-412-5p对细胞A549迁移、侵袭的影响 C、D：抑制PCDH10能逆转抑制miR-412-5p对细胞A549迁移、侵袭蛋白表达的影响注：与anti-miR-NC组比较，*P<0.05；与anti-miR-412-5p+si-NC组比较，#P<0.05

3 讨论

据统计，2018年，全球新增肺癌病例210万例，死亡病例180万例[9]。肺癌的发病机制尚未完全阐明，因此，研究肺癌进展的分子机制，探寻有效的治疗策略对于肺癌的治疗至关重要。既往研究表明，许多分子参与了肺癌的发生和发展，包括与miRNA相关的表观遗传学调控的改变[10-11]，因此，本研究考察miR-412-5p对肺癌细胞生物学行为的影响，并对其可能的分子机制进行初步探索。

大量证据表明，miRNA通过结合靶mRNA的3’UTR区域，转录后调控基因表达，影响细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等多种生物学过程，与包括肺癌在内的多种人类肿瘤密切相关，如miR-135a-5p[12]、miR-512-5p[13]、miR-148a[14]。miR-412-5p是其中一种miRNA，研究表明，抑制miR-412-3p可降低结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡[15]。但关于miR-412-5p对肺癌细胞毒性作用的研究罕见报道。本研究利用qPCR检测肺癌组织中miR-412-5p表达，数据显示，与癌旁组织比较，肺癌组织中miR-412-5p表达明显上调(P<0.05)。抑制miR-412-5p明显降低肺癌细胞A549迁移细胞数、侵袭细胞数、Cyclin D1、MMP-2蛋白表达(P<0.05)，而提高24 h、48 h、72 h的细胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白水平，说明miR-412-5p可能在肺癌发生发展过程中充当肿瘤致癌基因，抑制其表达则抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭，提示miR-412-5p可能成为肺癌诊断和治疗的生物标志物。

PCDH10已被证明是一种抑癌基因，可作为胰腺癌[16]、乳腺癌[17]、结直肠癌[18]等的诊断和预后生物标志物。报道指出，PCDH10的上调抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[19]。本实验的Western blot和免疫组化检测结果显示，与癌旁组织比较，肺癌组织中PCDH10表达量显著减少(P<0.05)，与张洁等[8]等的研究一致。Starbase软件预测出miR-412-5p与PCDH10的3’UTR具有靶向结合位点，猜想PCDH10可能是miR-412-5p的下游靶基因之一。双荧光素酶报告实验和Western blot实验证实了这一推测，即miR-412-5p可以靶向调控PCDH10表达。另外，抑制PCDH10能逆转抑制miR-412-5p对细胞A549增殖、迁移、侵袭、Cyclin D1、MMP-2蛋白表达的抑制作用，以及逆转其对E-cadherin蛋白表达的促进作用。这些数据表明，靶向调控PCDH10表达是miR-412-5p影响肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的重要途径之一。

本研究发现，与癌旁组织比较，miR-412-5p在肺癌组织中明显上调，PCDH10表达下调。抑制miR-412-5p表达显著抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭，其作用机制与靶向调控PCDH10表达有关，这为肺癌发病机制的深入研究提供了新的线索，也为肺癌的治疗提供了潜在靶标。