白藜芦醇调控LINC00460/TWIST1抑制胶质母细胞瘤侵袭迁移的研究*

蔡 皞，欧阳佳，王 磊，任年军

（1.湖南省肿瘤医院/中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，湖南 长沙 410013；2.吐鲁番市人民医院，新疆 吐鲁番 838000）

胶质母细胞瘤又被称为多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM），是成人最常见的颅内恶性肿瘤，约占原发性脑肿瘤的17%[1]。GBM细胞往往易于浸润性生长，并侵袭周围的正常脑组织，因此被认为是胶质瘤中恶性程度最高的类型[2]。这种侵袭性表型是导致GBM治疗失败和术后复发转移的重要原因[3]。因此，进一步解析GBM这种高侵袭性表型的潜在机制，针对性开发新的治疗方法将有望使患者生存获益。

白藜芦醇（resveratrol）是存在于葡萄、浆果、花生和葡萄酒中的一种具有丁苯结构的天然多酚[4]。同时，白藜芦醇也是多种中药材的有效成分，如虎杖、买麻藤、甘松等。多项研究证实，白藜芦醇具有心血管保护、抗炎、抗衰老等生物活性[5-6]。最近的研究发现，白藜芦醇对多种类型的癌症显示出强大的抗肿瘤活性。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一个动态的细胞生物过程，以细胞失去上皮样特性转化为间充质表型为基本特征，在胚胎发育、创伤愈合和组织重塑等过程中起到了关键调控作用[7]。近年来，越来越多的研究表明[8]EMT参与到肿瘤进展过程中，与肿瘤细胞的侵袭和迁移密切相关。这提示EMT可能与GBM细胞的高侵袭性存在关联。研究表明[9-11]，白藜芦醇可对EMT的发生起调节作用，但具体调控机制仍未完全阐明。LINC00460是在多种肿瘤细胞中高表达的长链非编码RNA基因[12]。有研究显示LINC00460能调控EMT影响非小细胞肺癌的转移[13]。我们发现LINC00460的表达可被白藜芦醇抑制。因此，本研究以高侵袭转移能力的U87MG-trans为细胞模型，探讨白藜芦醇对GBM细胞表型的影响，并考察其具体分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器GBM细胞系U87MG购自中国科学院上海细胞生物学研究所，批号：3131C0001000700138。U87MGtrans为课题组前期通过Transwell侵袭小室构建的高侵袭转移能力的U87MG亚群[14]。胎牛血清（批号：16000044）、DMEM培养基（批号：12800017）、胰酶（批号：25200056）（Gibco公司）；TRIzol（Invitrogen公司，批号：15596026）；PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒（TaKaRa公司，批号：RR047A）；SYBRRPremix Dimer－EraserTM试剂（TaKaRa公司，批号：RR091Q）；Matrigel（BD公司，批号：356234）；ECL化学发光液（Thermo公司，批号：34094）。Forma 371型CO2培养箱（Thermo公司）；HCB-900V型超净工作台（海尔）；ST16R型离心机（Thermo公司）；K3型酶标仪（Thermo公司）；PowerPac型电泳仪及转膜仪（Bio-rad公司）；IX73型显微镜（奥林巴斯）；LightCycler 480 II Real-Time PCR系统（Roche公司）。

1.2 在线数据分析 利用GEPIA2.0在线数据库的生存分析模块分析TCGA-GBM数据集中候选基因的表达与患者预后的关系。通过PEARSON相关分析模块，分析TCGA-GBM表达数据集中目标分子间的表达相关性。

1.3 细胞培养 所有细胞培养于含有10%胎牛血清（FBS）DMEM培养基中，培养体系中添加1%的青霉素-链霉素，培养条件为恒温37℃的含5%CO2的细胞培养箱。当细胞达到90%汇合时采用胰酶消化，以1∶3的比例进行传代培养。当细胞生长至50%汇合时，采用浓度为0、20、40 μmol/L的白藜芦醇孵育细胞，进行后续实验。

1.4 MTT实验 采用MTT测定细胞活力。接种细胞于96孔板中培养过夜，使用白藜芦醇孵育细胞36h。将20μL MTT（5mg/mL）加入到每个实验孔中孵育4 h。弃去上清液后加入DMSO，使用酶标仪在570 nm波长处检测吸光度。

1.5 RNA提取和实时定量qPCR实验 使用TRIzol法裂解细胞并提取总RNA。根据PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒的说明书进行逆转录合成cDNA。使用SYBRRPremix DimerEraserTM试剂盒在LightCycler 480ⅡReal-Time PCR系统上检测目的基因的表达水平，相对表达量使用2-ΔΔCt法进行计算。引物序列为GAPDH-F：5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’；GAPDH-R：5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’；LINC00460-F：5’-ACATC GGAGGTACCCAGACA-3’，LINC00460-R：5’-GAAAGCTGCAACATGCTCCC-3’。

1.6 Transwell及划痕实验 将含有2×103个细胞的悬浮液接至涂有包被了Matrigel（以1∶7稀释）的Transwell小室中。底部小室内加入600 μL含20%FBS的DMEM培养基。孵育48 h后，将Transwell小室在4%多聚甲醛中固定20 h，用结晶紫染色20 h，并使用显微镜计数穿透小室的细胞数量。在每个样品随机选择5个区域进行计数，统计细胞数量。

提前1 d将细胞接种于6孔板，待其生长至100%汇合。用枪头垂直于细胞平面，沿着直尺进行划痕，PBS清洗掉从细胞板上脱落的细胞后，更换新鲜无血清培养基。开始记时，分别于0、24 h在显微镜下观察并测量划痕的宽度，并拍照。

1.7 蛋白质印迹实验 提取各组细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量。每个样品取20 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，并转膜至PVDF膜上。使用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，TBST清洗10 min×3次。一抗（1∶1 000稀释于含5%脱脂奶粉的TBST）于4℃孵育过夜，TBST清洗10 min×3次。二抗（1∶1 000稀释于含5%脱脂奶粉的TBST）室温孵育1 h，TBST清洗10 min×3次。使用ECL化学发光液与膜孵育3 min，进行曝光拍照。

1.8 统计学方法 使用SPSS 23.0进行统计分析，使用GraphPad Prism 7进行数据可视化。每个独立实验重复3遍。计量资料以“均数±标准差”（±s）表示。两组之间比较采用t检验进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 LINC00460在高侵袭性GBM细胞中高表达 我们首先检测了不同亚群细胞里LINC00460的表达水平（见图1），LINC00460在高侵袭转移能力GBM细胞亚群U87MG-trans中高表达，提示该lncRNA可能与GBM细胞的侵袭转移能力有关。通过在线数据库生存分析发现，LINC00460高表达的GBM患者总生存期较短（见图2）。

图1 LINC00460在高侵袭转移的GBM细胞中高表达s，n=3）

图2 LINC00460高表达与GBM患者预后不良相关分析

2.2 白藜芦醇抑制U87MG-trans细胞的侵袭迁移MTT实验结果显示，当使用白藜芦醇处理细胞时，U87MG-trans细胞存活率与U87MG细胞比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图3）Transwell和划痕实验结果显示，随着白藜芦醇浓度的增加，细胞侵袭和迁移的能力均被抑制，且呈剂量依赖性。（见图4）

图3 白藜芦醇对GBM细胞增殖的影响s，n=3）

图4 白藜芦醇对GBM细胞侵袭、迁移能力的影响s，n=3）

2.3 白藜芦醇抑制LINC00460的表达并阻止EMT发生 我们检测了白藜芦醇作用下LINC00460的表达变化。结果显示，白藜芦醇孵育可导致LINC00460表达降低。（见图5）通过在线数据分析发现，LINC00460与EMT关键转录因子TWIST1的表达在TCGA-GBM表达数据集中显著正相关（见图6，相关系数R=0.48，P=1.3e-10）。进一步通过蛋白印迹实验发现，白藜芦醇可抑制LINC00460表达，过表达抑制的增加，TWIST1和间充质样标志物Vimentin的表达显著下调，上皮样标志物E-cadherin的表达显著上调。（见图7）

图5 白藜芦醇抑制GBM细胞中LINC00460的表达s，n=3）

图6 在TCGA-GBM数据集中LINC00460与TWIST的表达显著正相关

图7 白藜芦醇对EMT相关蛋白的影响

2.4 过表达LINC00460可部分恢复白藜芦醇对GBM细胞的抑制作用 在GBM细胞中瞬时转染LINC00460过表达质粒，qRT-PCR检测发现，LINC00460上调了5.7倍。（见图8A）进一步研究发现，在白藜芦醇处理的细胞中瞬时转染LINC00460过表达质粒可部分恢复细胞的侵袭转移能力（见图8B、8C），提示白藜芦醇通过抑制LINC00460的表达阻止EMT发生，进而影响GBM细胞的侵袭和转移。

图8 过表达LINC00460逆转白藜芦醇（40 μmol/L）对GBM细胞侵袭迁移的抑制作用

3 讨 论

高侵袭性生长是胶质母细胞瘤的重要特征，也由此使得GBM患者的预后较差。因此，必须找到针对GBM细胞这种特性的合适药物。与常规化疗药物相比，中药处方往往副作用较少[15]。中药在肿瘤辅助治疗中也展示了一定的治疗效果[16]。此外，多种抗肿瘤药物为提取自植物中天然活性成分。例如从长春花叶中提取的长春新碱，治疗急性淋巴细胞白血病、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤非常有效[17]。紫杉醇是从红豆杉中直接提取出来的一种具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物，广泛应用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的治疗[18-19]。然而，中医药及其活性提取物是否能应用于GBM的治疗仍研究较少。

EMT通常在肿瘤细胞侵袭和转移过程中被激活，与肿瘤转移密切相关。HUANG P等[20]研究表明，GBM细胞转移过程中可能会经历EMT过程，从而获得更好的细胞运动性。白藜芦醇被证明能够抑制GBM细胞增殖并增加细胞死亡率[21-22]。近期有研究证明，白藜芦醇可通过调节细胞的EMT抑制胰腺癌细胞和胃癌细胞的侵袭和迁移[11,23]。但是，白藜芦醇是否可以抑制GBM细胞中的EMT，从而降低其侵袭迁移能力尚未完全明确。在本研究中，我们的团队发现白藜芦醇能够抑制GBM细胞的侵袭迁移，且在此过程中伴随着间充质样细胞标志物Vimentin的下调和上皮样细胞标志物E-cadherin的上调，提示白藜芦醇对EMT的调控影响了细胞的侵袭、迁移能力。为了进一步考察白藜芦醇抑制GBM侵袭迁移的分子机制，我们进行了分子生物学实验。研究发现，LINC00460在高侵袭转移能力的GBM细胞亚群中显著上调，且其表达可被白藜芦醇显著抑制。进一步生物信息学分析发现，EMT关键转录因子TWIST在GBM中的表达与LINC00460的表达显著正相关，推测TWIST是LINC00460的下游基因。结合蛋白印迹实验结果，我们推测白藜芦醇可通过抑制LINC00460表达，下调TWIST从而抑制EMT，最终降低GBM细胞的侵袭、迁移能力。为证明这一推测，我们继续进行了挽救实验。我们发现，上调LINC00460表达可部分恢复白藜芦醇对GBM细胞侵袭迁移能力的抑制作用，这与预期一致。本研究并未阐明白藜芦醇抑制LINC00460表达的具体分子机制。目前已知白藜芦醇的直接作用靶点包括PTGS1、CSNK2A1、NQO2、PTGS2等，其对LINC00460的抑制作用是通过这些直接靶点来间接调控，抑或是LINC00460能够直接与白藜芦醇药物分子发生直接作用，仍需进一步研究。另外，TWIST1是EMT发生的重要转录因子，我们的结果推测它是LINC00460的下游基因，其具体分子机制也需要进一步的研究来阐明。

综上所述，白藜芦醇可抑制GBM细胞的侵袭、迁移能力。白藜芦醇的这一作用是通过抑制LINC00460表达，从而下调TWIST介导的EMT来实现的。本研究结果可为白藜芦醇运用于GBM的治疗提供理论基础。