假木豆对CCl4致大鼠肝损伤的保护作用*

姚 平，杨翼菲，夏 星，林国彪

（1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200）

肝脏是机体重要的代谢器官，肝脏疾病是危害机体健康的严重疾病之一，病毒、药物、酒精等多种因素均会造成肝细胞病变，引起肝纤维化，甚至发展成为肝硬化、肝衰竭等恶性疾病[1]。近年来，中药抗肝损伤的实验研究是临床研究的热点，为治疗提供了许多新思路。假木豆广泛分布于我国广西、广东、海南等省份，味辛、甘，性寒，具有舒经活络、清热凉血、健脾利湿的功效，在骨折、风湿骨痛、咽喉肿痛、内伤吐血等疾病的治疗中应用较为广泛。假木豆各部分提取物具有抗菌活性[2]，保肝及抗肝纤维化作用机制尚无相关报道。本次研究采用四氯化碳（CCl4）致大鼠肝损伤模型[3]，通过观察肝脏形态学改变和相关生化指标的变化，探讨假木豆对肝损伤的保护作用和机制，为假木豆药用资源的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物6～8周龄SPF级SD健康大鼠40只，雌雄各半，体质量（190±10）g，由广西医科大学提供，许可证号：SCXK（桂）2020-0003。分笼饲养，恒温恒湿适应性饲养1周，期间自由进食、饮水。经医学实验动物管理委员会批准，饲养严格遵循动物实验要求执行。

1.2 药物与试剂 复方联苯双酯片（广州白云山天心制药股份有限公司，国药准字H44024819，批号：201828）；假木豆由广西中医药大学附属瑞康医院药房提供，采自广西地区，经鉴别为正品；CCl4（天津市大茂化学试剂厂，批号：20091250）；TBIL检测试剂盒（批号：2400087）、ALT检测试剂盒（批号：2400737）、AST检测试剂盒（批号：2400136）（北京科美生物技术有限公司）；TNF-α ELISA试剂盒（批号：2401885）、IL-1 ELISA试剂盒（批号：2401961）、IL-6 ELISA试剂盒（批号：2403182）、IL-10 ELISA试剂盒（批号：2403980）（武汉纯度生物）；MDA检测试剂盒（批号：S0131S）、SOD检测试剂盒（批号：S0086）、GSH检测试剂盒（批号：S0053）、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（批号：c0105S）（碧云天公司）；RT-PCR试剂盒（Solarbio公司，批号：C11730017）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 主要仪器Selectra-E型动物全自动生化分析仪（荷兰VITALAB）；DMD108光学显微镜（德国徕卡）；Lightwave S2000紫外分光光度计（英国WPA）；CLARIOstar Plus酶标仪（德国BMG）；DK-2000-IIIL型水浴锅（广东佛衡）；KD-TS3A型全自动生物组织脱水机、KD-BMIV型组织冷冻包埋机（金华科迪）；885300-0002匀浆器（美国Kimble）；CUT4062病理切片机（德国SLEE）；H2100R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪）；CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD）。

1.4 造模与分组 取30只大鼠随机分为模型组、联苯双酯组和假木豆组，每组10只，采用CCl4制备肝损伤大鼠模型[4]：适应性饲养结束后，使用0.1% CCl4花生油溶液腹腔注射，剂量为10 mL/kg，2次/周，连续注射6周。以大鼠肝细胞病理检查显示肝细胞排列紊乱，广泛的脂肪变性及肝细胞水肿、脂肪空泡、纤维组织增生，炎症细胞浸润为造模成功。另选取10只大鼠作为空白对照组。

1.5 实验给药 按大鼠的等效剂量相当于人的6.3倍换算用药剂量。假木豆组大鼠灌胃给予假木豆水提物，100 mg/kg；联苯双酯组大鼠灌胃给予复方联苯双酯片水溶液，100 mg/kg；空白对照组和模型组大鼠灌胃给予生理盐水；灌胃体积均为10 mL/kg；1次/d，6次/周，连续6周。末次灌胃后禁食24 h，禁水12 h，称量大鼠体质量，经腹主动脉取血，分离血清；使用颈椎脱臼法处死大鼠，摘除肝脏并称质量，取部分肝组织制备10%肝匀浆，取部分肝组织采用4%多聚甲醛固定。

1.6 观察指标

1.6.1 肝脏病理形态学分析 取部分多聚甲醛固定肝组织，乙醇梯度脱水，透明、石蜡包埋、切片后行苏木精-伊红（HE）染色，具体步骤为二甲苯浸泡15 min，100%～50%乙醇梯度冲洗3 min，蒸馏水冲洗1 min，苏木精浸泡15 min后，再次使用蒸馏水冲洗15 min。完成伊红染色后再次使用酒精和二甲苯浸泡，最后中性树胶封片，在光学显微镜下观察肝组织病理学变化。

1.6.2 肝功能检测 使用全自动生化分析仪测定TBIL、ALT、AST水平，严格按照试剂盒说明书操作步骤执行，血清标本在4℃条件下以5 000 r/min离心10 min，分离上层血清，将试剂及血清标本混匀后37℃孵育5 min，1 min后采用分光光度计读取340 nm处吸光度，连续测量3次取平均值。

1.6.3 炎症因子、纤维化因子检测 腹主动脉血液样本采用ELSIA法检测血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10水平，血清标本分离后取上清液，-20℃冻存；血清标本加入50 μL样本分析缓冲液后加入相应的孔中后室温孵育2 h，洗板5次加入抗体工作液100 μL，室温孵育1 h；加入酶结合物工作液100 μL，避光孵育20 min；加入显色剂后避光孵育20 min，加入50 μL终止液，混匀后测量450 nm处OD值，设置空白孔，根据标准品绘制标准曲线得到各指标在标准曲线上的浓度。

1.6.4 氧化应激指标检测 取0.1 g肝脏组织加入1 mL提取液，匀浆后离心分离取上清液，吸取0.3 mL试剂加入离心管，并加入0.1 mL样本混匀，95℃水浴30 min，随后冰浴冷却，25℃离心10 min，吸取上清液置于96孔板，分别测定600 nm、532 nm处吸光度，计算各指标在肝脏中的含量。

1.6.5 大鼠肝纤维化因子基因表达检测 称取少量冻存肝脏组织，经Trizol一步法提取总RNA，检测RNA浓度和纯度；取3μg总RNA反转录为cDNA，行PCR扩增，扩增条件：预变性95℃10 min，95℃、15 s变性，55～60℃、45℃退火，循环（40次），熔解曲线60℃→95℃，每15 s升温0.3℃。引物序列：GADPH上游5’CTGGAGAAGGAGTAGTAGTAG-3’，下游5’GGTGCCAG ACCTGTAGTGCT-3’；HA上游5’CTGACTAGGGVTGACAT-3’，下 游5’AGTCTGATGCTGCCGCAT-3’；TGF-β1上 游5’ATT CCTGTGAGTCGTATTGG-3’，下游5’AGCCTGTATTCCTCTCCCT-3’；α-SMA上游5’AGGAGGTAGTCCCGTACATG-3’，下游5’GGTGATCCCTGATGATGCT-3’。采用2-△△Ct法 计算HA mRNA、TGF-β1 mRNA、α-SMA mRNA基因相对表达量。

1.7 统计学方法 使用SPSS 25.0统计软件，计量资料以“均数±标准差”（s）表示，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肝组织病理学改变情况 空白对照组大鼠肝细胞正常，无变性坏死，排列整齐，汇管区结构清晰完整，细胞核与细胞浆对比鲜明；模型组大鼠肝细胞排列紊乱，可见广泛的脂肪变性及肝细胞水肿，肝细胞胞浆内可见大小不等的脂肪空泡，肝组织内纤维组织增生等，胞质界限模糊，伴有炎症细胞浸润；联苯双酯组和假木豆组大鼠肝细胞排列基本正常，出现部分肝细胞水肿及脂肪变性，未见明显肝纤维化；与模型组比较，肝细胞病变明显减轻。（见图1）

图1 各组大鼠肝组织病理切片图（HE，×400）

2.2 各组大鼠肝功能指标比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清TBIL、ALT、AST水平，肝脏指数均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，联苯双酯组和假木豆组大鼠血清TBIL、ALT、AST水平，肝脏指数均明显降低（P＜0.05），但仍高于空白对照组（P＜0.05）；假木豆组大鼠血清TBIL、ALT、AST水平，肝脏指数与联苯双酯组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠肝功能指标比较

表1 各组大鼠肝功能指标比较

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）TBIL（μmol/L）AST（U/L） ALT（U/L） 肝脏指数（%）空白对照组 10 - 14.28±2.89 112.38±10.95 29.68±8.54 3.25±0.27模型组 10 - 30.67±4.16a 215.44±35.82a 75.18±18.65a 4.38±0.51a联苯双酯组 10 100 20.37±3.98ab 127.96±12.58ab 41.34±11.97ab 3.67±0.35ab假木豆组 10 100 22.56±4.05ab 130.37±13.86ab 44.56±12.59ab 3.72±0.38ab F 31.717 49.588 20.856 14.538 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 各组大鼠血清氧化损伤指标比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清MDA水平明显升高，SOD、GSH水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，联苯双酯组和假木豆组大鼠血清MDA水平明显降低，SOD、GSH水平明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；假木豆组大鼠血清MDA、SOD、GSH水平与联苯双酯组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠血清氧化损伤指标比较

表2 各组大鼠血清氧化损伤指标比较

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）MDA（mmol/L）SOD（U/mL）GSH（μmol/L）空白对照组 10 - 6.07±1.14 125.72±7.81 413.60±38.46模型组 10 - 14.18±2.51a 70.28±11.59a 302.53±41.38a联苯双酯组 10 100 8.95±2.13b 116.54±10.28b 370.29±45.50b假木豆组 10 100 9.57±2.28b 110.59±9.34b 375.36±39.15b F 26.018 62.051 12.557 P 0.000 0.000 0.000

2.4 各组大鼠血清炎症因子表达比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明显升高，IL-10水平明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，联苯双酯组和假木豆组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明显降低，IL-10水平明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。假木豆组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α、IL-10水平与联苯双酯组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠血清炎症因子表达比较

表3 各组大鼠血清炎症因子表达比较

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）IL-1（ng/L）IL-6(ng/L）TNF-α（μg/L）IL-10(ng/L)空白对照组10 - 40.28±3.75 25.86±4.59 11.68±2.15 124.30±15.82模型组 10 - 67.18±4.05a 127.98±15.77a 34.72±6.86a 84.37±13.75a联苯双酯组10 100 45.54±5.16b 45.83±6.91b 17.75±3.81b 108.96±12.29b假木豆组 10 100 42.81±4.88b 50.69±7.16b 18.34±4.02b 110.73±15.16b F 75.287 218.650 47.300 13.478 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 各组大鼠肝纤维化因子基因表达比较 与空白对照组比较，模型组大鼠HA mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，联苯双酯组和假木豆组大鼠HA mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达量明显降低（P＜0.05）；假木豆组大鼠HA mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达量与联苯双酯组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠肝纤维化因子基因表达比较

表4 各组大鼠肝纤维化因子基因表达比较

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）HA mRNA α-SMA mRNA TGF-β1 mRNA空白对照组 10 - 0.34±0.05 0.82±0.15 1.02±0.08模型组 10 - 1.28±0.24a 1.71±0.31a 1.65±0.19a联苯双酯组 10 100 0.41±0.10b 0.97±0.20b 1.13±0.12b假木豆组 10 100 0.44±0.12b 1.02±0.23b 1.24±0.15b F 93.172 29.642 38.119 P 0.000 0.000 0.000

3 讨 论

本次研究采用CCl4制备肝损伤大鼠模型。作为一种肝毒性化学物，CCl4是化学性肝损伤的常用造模试剂，长期反复接触会产生头晕、乏力、食欲不振、恶心等症状[5]，严重者会出现肝功能异常甚至肝硬化。对大鼠长期使用CCl4能使肝细胞变性、坏死，产生炎症反应。在中医理论中，肝为刚脏，体阴而用阳。肝脏受到化学物、酒精等毒素的侵袭会损耗肝阴，导致肝脏阴阳失衡，从而引起肝脏病理改变[6]。

本次研究显示，造模后大鼠肝脏形态学发生改变，CCl4毒性使得大鼠肝组织局灶性坏死，对肝细胞造成损伤，并提高IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子的释放，引发炎症反应[7]。血清中ALT、AST是评价肝脏损伤程度的常用指标，其水平越高表示肝损伤的程度越严重[8]，当细胞膜受到伤害后细胞内的ALT、AST会通过细胞膜进入血液中，导致血液中ALT、AST水平升高。相关研究显示，血清中ALT、AST活力的大小直接反映了肝损伤的程度[9]。肝脏对胆红素的代谢具有重要作用，肝脏发生病变后胆红素在血液中积聚，表现为TBIL水平明显升高。本次研究显示，假木豆组大鼠血清TBIL、ALT、AST水平明显低于模型组（P＜0.05），与联苯双酯组水平相当，证实假木豆能够有效降低血清TBIL、ALT、AST水平，保护肝功能。

肝损伤发生发展过程中，氧化应激反应扮演了重要角色。氧化应激是指抗氧化防御和细胞内活性氧之间的平衡被打破，从而对肝脏造成损伤[10]。MAD是反映机体内脂质过氧化程度和细胞氧化损伤的指标，可间接反映细胞损伤的程度；SOD活力水平是机体内清除氧自由基能力的体现，正常水平的SOD能够预防和修复氧化应激引起的肝损伤。GSH是LOOH、等低分子自由基的清除剂，是GSH-PX的底物，可用于氧化应激和脂质过氧化损伤程度的评估。上述三者常被用于评价机体氧化应激和抗氧化应激平衡[11]。本次研究中，模型组大鼠血清MDA水平明显升高，SOD、GSH水平明显降低（P＜0.05），说明肝损伤大鼠体内氧化应激反应增强。经过假木豆干预后，大鼠血清MDA水平明显降低，SOD、GSH水平明显升高（P＜0.05），证实假木豆对肝损伤具有抗氧化保护作用，能够降低肝组织中MDA水平，提高SOD、GSH水平，减轻肝组织氧化应激损伤。

IL-6和TNF-α是代表性的促炎性细胞因子。IL-6是反映机体炎症反应程度的敏感指标，在机体内过度分泌会直接损伤肝细胞，使中性粒细胞向肝内浸润，造成肝脏微循环障碍，同时可以诱导肝细胞合成CRP，进一步加大炎症反应，加重肝损伤[12]。TNF-α具有释放炎症介质，促进炎症细胞聚集的作用，与IL-6的分泌相互促进，共同诱发炎症反应[13]。IL-10作为一种抗炎细胞因子能够减轻炎症的反应程度，适当分泌可中和促炎性细胞因子[14]。本次研究显示，模型组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明显升高，IL-10水平明显降低（P＜0.05），证实肝损伤大鼠体内存在强烈的炎症反应。经过假木豆干预后，大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α水平明显降低，IL-10水平明显升高（P＜0.05），与联苯双酯组相当，证实假木豆具有抑制炎症反应，降低肝损伤的效果。

肝纤维化是肝内结缔组织增生与降解失衡而产生的沉积[15]，是多数肝病共有的特征。抗肝纤维化治疗是肝损伤治疗的重要部分。α-SMA是平滑肌肌动蛋白中比例最高的亚型，具有收缩细胞和促进细胞形成的作用[16]。正常情况下，肝脏中仅在大血管壁中表达，若发现在其他肝组织中表达则提示发生肝纤维化，因此可用来评价肝纤维化严重程度[17]。HA是肝纤维化四项检查的指标之一，对早期肝纤维化具有一定的预警作用，长期高水平会发展成为肝硬化[18]。TGF-β1是肝脏病理损伤过程中的重要因子，也是导致肝纤维化的重要因素，能够激活肝星状细胞，促进细胞外基质大量合成[19]。本次研究显示，模型组大鼠HA mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达量明显升高（P＜0.05），证实肝损伤模型大鼠存在肝纤维化。经过假木豆干预后，HA mRNA、α-SMA mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达量水平明显降低（P＜0.05），证实假木豆可降低HA、α-SMA、TGF-β1基因表达，从而对CCl4引起的肝纤维化具有一定的治疗作用。

综上所述，假木豆能够有效改善CCl4致大鼠肝损伤，对肝功能具有良好的保护作用，其作用机制可能与抗氧化应激、抑制炎症反应、阻断肝纤维化有关。