牛膝醇提物对实验兔膝骨关节炎模型AMPK/Wnt/MAPK信号通路串话的影响*

马笃军，华树良，彭力平，蒋顺琬，曹亚飞，高 坤，王立新，莫益斌

（1.广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518033；2.百色市人民医院/右江民族医学院附属西南医院，广西 百色 533000；3.百色市人民医院隆林分院，广西 隆林 533499）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）以关节软骨退行性变为核心病理改变，好发于中老年人[1]。近年来，膝关节OA在年轻人群中发病越来越多。OA致残率高，对健康危害极大，给患者、家庭和社会带来了巨大的经济负担，目前尚无理想治疗药物[2]。前期研究表明牛膝对实验兔OA模型关节软骨损伤具有促进修复作用[3-4]，具体信号通路不清楚。信号通路可在分子水平上对疾病的发生、发展及治疗机制进行解释，而OA的发病机制涉及多种信号通路互作，不是局部或者单一发生作用，因此治疗也应该从整体出发进行多通路互作研究[5]。故课题组拟深入研究探讨牛膝有效成分醇提物对实验兔膝OA模型腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/Wnt/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信号通路的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物2～3个月龄普通级健康新西兰大白兔64只，雌、雄各半，体质量（1.36±0.73）kg，购自广东省实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（粤）2019-0035。饲养环境：温度20℃，湿度40%。于2019年1月至2019年12月在广州中医药大学第四临床医学院中心实验室、深圳市中医药研究所完成，获得实验动物伦理委员会批准，实验操作符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 药物与试剂 牛膝醇提物（怀牛膝，广州中医药大学第四临床医学院药剂科制备，院内制剂）；10%甲醛标本固定液、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，Cox2）抗体（货号：4842S）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抗体（货号：9252S）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）抗体（货号：9102S）、P38抗体（货号：9212s）（CST公司）；AMPK抗体（Lifespan公司，货号：LS-B14414-50）；β-连环蛋白（β-catenin）抗体（Merck公司，货号：MAB2081）；Tubulin抗体（Genetex公司，货号：GTX11214）；苏木素染料抗体（Servicebio公司，货号：G1004）。

1.3 主要仪器EG11504型包埋机、ASP300S脱水机、EG1150C型冷却台、RM2235型切片机（Leica公司）；Mshot MF53型显微镜（广州明美光电）；EPS-200型电泳仪、VE180C电泳槽、VE-586型转膜槽（誉维生物）。

1.4 造模与分组 将64只实验兔按照随机数字表法分为造模组50只、空白对照组（未造模）14只，将实验兔右膝关节用棉垫包裹好后于伸直位管型石膏固定制动6周，石膏外层缠绷带[6]。每天监测生命体征、查看石膏固定松紧情况。造模6周后，从造模组和空白对照组各随机抽取2只实验兔进行膝关节比较，空气栓塞法处死，从兔右膝髌骨内侧纵行切开，行膝关节标本大体观察，取胫骨平台同一部位3mm×5 mm软骨组织，留作病理HE染色，观察组织结构。造模成功标准参照改良Mankin's评分标准[3]：关节表面出现不规则裂隙、软骨基质染色减退、软骨潮线结构不完整。造模成功后，将48只实验兔随机分为模型对照组、牛膝醇提物低剂量组、牛膝醇提物中剂量组、牛膝醇提物高剂量组，每组12只。

1.5 实验给药 怀牛膝在2015年版《中华人民共和国药典》[7]人体常规最高用量为每日12 g，根据药物试验等效剂量换算，实验兔每日用量约1 g/kg，牛膝醇提物每毫升醇提液相当于含原材料1 g。按照常规用药量的1、3、6倍，分别予牛膝醇提物低、中、高剂量组实验兔低、中、高剂量[1、3、6 mg/（kg·d）]牛膝醇提物灌胃，2次/d，每次灌胃时用蒸馏水配成15 mL，连续用药6周。空白对照组、模型对照组按照上述灌胃方法，予等量蒸馏水灌胃，15 mL/次，2次/d，连续6周。

1.6 观察指标

1.6.1 软骨组织病理学HE染色观察 实验兔连续灌胃6周后用过度麻醉处死实验兔，然后用手锯小心切取右膝胫骨平台外侧髁负重区同部位3 mm×5 mm软骨组织，新鲜标本以10%中性甲醛溶液固定48 h，3%硝酸溶液脱钙24～36 h，然后常规脱水、包埋，连续切片，厚4～5 μm，进行HE染色。

1.6.2 软骨组织改良Mankin’s评分 软骨组织HE染色后光镜下观察形态变化，采用改良Mankin’s法对关节软骨结构、细胞、染色及潮线的完整性进行评分。评分标准见表1。

表1 切片关节软骨组织学改良Mankin’s评分表

1.6.3 免疫组化检测关节软骨AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表达 留取软骨组织，新鲜标本以10%中性甲醛溶液固定48 h，然后常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚3～4 μm，留做免疫组化染色，测定AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表达情况。具体操作步骤如下，石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15 min-二甲苯Ⅲ15 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-85%酒精5 min-75%酒精5 min蒸馏水洗。抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8 min至沸，停火8 min保温再转中低火7 min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，5 min/次。阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育10 min，将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，5 min/次。血清封闭：在组化圈内滴加5%山羊血清均匀覆盖组织，室温封闭30 min。加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。加二抗：一抗室温复温30 min，玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，5 min/次。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50 min。DAB显色：玻片置于PBS（pH=7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，5 min/次。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。复染细胞核：苏木素复染5 min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。脱水封片：将切片依次放入75%酒精5 min-85%酒精5 min-无水乙醇Ⅰ5 min-无水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。显微镜下采集图像。蓝色的为细胞核，棕色的为阳性点。

1.6.4 Western blotting检测关节软骨AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表达 取软骨组织剪碎后，加蛋白裂解液，用组织匀浆器研磨（加蛋白酶抑制剂1∶100+PMSF 1∶100+磷酸酶抑制剂1∶100）冰上裂解，4℃12 000 r/min离心15 min，离心半径60 mm，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测总蛋白量，水浴变性5 min，冷却后上样，跑胶，电转，封闭，加入一抗：按照抗体说明书稀释抗体，用5%BSA的TBST稀释，4℃孵育过夜，TBST洗涤5次，加入二抗：按照兔1∶10 000，鼠1∶5 000稀释抗体，TBST稀释、洗涤，显色：按1∶1配制发光液，覆盖在膜表面，最后图像采集分析。

1.6.5 AMPK/Wnt/MAPK信号通路关键蛋白相互作用网络机制预测 根据https://string-db.org/网址预测绘制AMPK/Wnt/MAPK信号通路关键蛋白AMPK、Wnt、MAPK、ERK2、JNK（SAPK）、p38、COX-2、beta-catenin相互作用网络机制图。

1.7 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件分析，计量资料用“均数±标准差”（±s）表示。采用单因素方差分析，不满足方差分析时用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 造模6周后，未见实验兔固定肢体出现坏死、褥疮等表现，空白对照组兔膝关节表面光滑，造模组兔膝关节有骨质增生、不规则裂隙、关节面硬化等表现。（见图1）造模过程未出现实验动物死亡，灌胃过程中出现3只实验兔死亡，其中模型对照组1只、牛膝醇提物中剂量组1只、牛膝醇提物高剂量组1只，造成实验兔死亡原因主要考虑是灌胃操作不当，导致药液灌入肺中造成窒息急性死亡。

图1 两组兔膝关节表面比较

2.2 各组兔软骨组织病理学改变情况 空白对照组兔软骨组织潮线结构、软骨细胞形态、软骨细胞排列纹理、基质染色等未见明显改变。模型对照组兔软骨组织血管入侵潮线结构，软骨细胞数量明显减少，软骨细胞排列纹理、基质染色变浅。牛膝醇提物低、中、高剂量组兔局部软骨表面可见不规则裂隙，达钙化层，软骨细胞数量增多，基质染色呈浅红色，潮线结构稍正常，与剂量呈递增趋势。（见图2）

图2 各组兔软骨组织病理改变（HE，×100）

2.3 各组兔膝关节病理学改良Mankin’s评分比较 模型对照组兔膝关节病理学改良Mankin’s评分明显高于空白对照组（P＜0.01）；牛膝醇提物中、高剂量组兔膝关节病理学改良Mankin’s评分明显低于模型对照组（P＜0.05或P＜0.01），牛膝醇提物低剂量组兔膝关节病理学改良Mankin’s评分与模型对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组兔膝关节病理学改良Mankin’s评分比较

表2 各组兔膝关节病理学改良Mankin’s评分比较

注：与空白对照组比较，aP＜0.01；与模型对照组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

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2.4 各组兔膝关节软骨AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表达比较 免疫组化结果显示，模型对照组兔膝关节软骨ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表达明显高于空白对照组（P＜0.05），AMPK蛋白表达与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；牛膝醇提物低、中、高剂量组兔膝关节软骨ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表达明显低于模型对照组（P＜0.05）；牛膝醇提物高剂量组兔膝关节软骨AMPK蛋白表达明显高于模型对照组（P＜0.05），牛膝醇提物低、中剂量组兔膝关节软骨AMPK蛋白表达与模型对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图3～4）

图3 各组兔膝关节软骨AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin表达比较）

Western blotting结果显示，模型对照组兔膝关节软骨ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表达明显高于空白对照组（P＜0.05），AMPK蛋白表达与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；牛膝醇提物低、中、高剂量组兔膝关节软骨ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表达明显低于模型对照组（P＜0.05）；牛膝醇提物高剂量组兔膝关节软骨AMPK蛋白表达明显高于模型对照组（P＜0.05），牛膝醇提物低、中剂量组兔膝关节软骨AMPK蛋白表达与模型对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图5）

图5 各组兔膝关节软骨组织AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表达Western blotting检测结果

2.5 AMPK/Wnt/MAPK信号通路关键蛋白相互作用网络机制预测图 在https://string-db.org/网址输入AMPK/Wnt/MAPK信号通路AMPK、Wnt、MAPK、ERK2、JNK（SAPK）、p38、COX-2、β-Catenin关键蛋白，可以输出关键蛋白之间相互作用网络机制三级预测图（来源：https://string-db.org/cgi/network.pl?taskId=qjKGQTZkskFu）。蛋白预测图结果显示，Akt家族蛋白节点最多，其次为Mapk家族蛋白节点，因此，Akt家族蛋白、Mapk家族蛋白在牛膝醇提物对AMPK/Wnt/MAPK信号通路网络互作之间的联系起了到关键桥接蛋白作用。（见图6）

图6 牛膝醇提物对AMPK/Wnt/MAPK信号通路关键蛋白相互作用网络机制预测图

图4 各组兔膝关节软骨组织AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin免疫组化图（×100）

3 讨 论

OA是临床常见病，虽然手术治疗OA发展迅速，如自身软骨或软骨细胞移植、关节置换等，但只适于极少数患者，药物治疗仍最常用[8]。但目前的药物仍存在一定的副作用，有些制剂还处于探索研究阶段，不能在临床常规应用。因此如何恢复关节软骨的完整性和正常功能，是目前OA研究的重点和难点[9]。

中医药治疗骨关节炎有一定的优势，中药含有多种有效成分，可多途径、多靶点发挥作用而提高疗效。牛膝是在此类中药中较为突出的一味，其主要有效成分包含黄酮类、甾酮类、多糖类、皂苷类等[10-12]。现代药理研究表明，黄酮类成分能抑制IL-6等炎症因子的分泌，通过AMPK通路抑制NF-κB向细胞核转移，导致细胞核内NF-κB的表达水平降低来抑制炎症因子；甾酮类成分可借助激活ERK/MAPK信号通路途径促进细胞增殖和细胞抗氧化作用；多糖类成分可通过上调Wnt-4、Frizzled-2、β-Catenin和cyclin D1的表达，下调GSK-3β的表达，激活Wnt/β-Catenin信号通路，促进Ⅱ型胶原的合成，达到软骨保护作用；皂苷类成分能通过降低Wnt通路β-Catenin蛋白磷酸化来下调β-CateninmRNA的表达和抑制Wnt信号通路，下调TGF-β1表达发挥抑制系膜细胞增殖的作用。因此，AMPK/Wnt/MAPK信号通路串话可能是牛膝醇提物对OA软骨修复作用的信号交互通路之一。

软骨细胞生长、成熟受多因素的影响，多种细胞因子和信号转导通路参与其中，组成了一个复杂多变的分子生物网络系统[13]。AMPK、Wnt和MAPK信号传导通路参与调节正常细胞生长、增殖、迁移、分化，调控正常组织重建，其发生异常改变与人类关节病变密切相关[14-15]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是细胞的能量感受器，在关节软骨细胞中，AMPK能被异常激活，AMPK磷酸化的激活可促进mTOR、P13K减少细胞凋亡[16]。本研究免疫组化和Western blotting结果显示牛膝醇提物能有效上调AMPK表达，说明牛膝醇提物具有减少软骨细胞凋亡的能力。Wnt/β-Catenin通路是一种独特的信号通路，可影响关节炎的发生、发展，主要是通过调节软骨细胞的分化、增殖、凋亡，以及调节关节软骨细胞外基质的合成与分解等而发挥调节作用，还可通过COX-2、IL、BMP2、MMPs、aggrecanases、RANKL/OPG比值变化来影响软骨代谢[17]。前期实验证实[4]，怀牛膝有效醇提物含药血清在体外能有效地促进软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原蛋白表达及糖胺聚糖的分泌。陈达等[18]对兔OA模型用牛膝醇提物灌胃后发现，实验组血液和关节液中IL-1β、TNF-α和MMP-3等炎症介质的含量明显低于空白对照组。目前的研究认为Wnt/β-Catenin信号通路是OA软骨破坏病程中最重要的信号通路之一，与本实验中软骨组织免疫组化病理、Western blotting结果提示牛膝醇提物能降低COX-2、β-Catenin蛋白表达相符合，表明Wnt/β-Catenin通路可能是牛膝醇提物促进软骨细胞增殖和抗凋亡的作用机制之一。MAPK是哺乳动物体内广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在OA病理过程中MAPK信号通路也参与并调节软骨细胞的凋亡、肥大化、钙化及增殖等生物学反应，例如当关节内炎症因子增多时，可激活细胞内的MAPK信号转导途径，引起MMPs表达增加、软骨细胞凋亡、软骨破坏等一系列反应，其中MAPK家族参与了OA发病的有JNK、p38和ERK，在MAPK家族中ERK主要受生长因子的激活，而JNK/p38通路则主要受细胞外的应激，以及细胞因子和低氧因素刺激而活化，并且在对软骨细胞的调节中3种亚型可以独自或同时被激活。本实验中ERK、JNK、p38蛋白在模型对照组高表达，在牛膝醇提物低、中、高剂量组表达依次呈降低趋势，说明牛膝醇提物对MAPK信号通路具有一定抑制作用。String蛋白预测图结果显示Akt家族蛋白、Mapk家族蛋白在牛膝醇提物对AMPK/Wnt/MAPK信号通路网络互作之间桥接蛋白节点最多，说明MAPK/AKT信号通路在牛膝醇提物治疗OA中发挥了不可替代的作用，与报道相符[19-20]。

本研究观察了牛膝醇提物对实验兔膝关节OA模型AMPK/Wnt/MAPK信号网络通路的影响，结果显示牛膝醇提物能改善兔膝关节OA模型病理评分，有效上调AMPK通路AMPK蛋白表达，下调Wnt通路β-Catenin、COX-2蛋白，以及MAPK通路JNK、P38、ERK蛋白表达；蛋白互作网络预测结果表明Akt家族蛋白、Mapk家族蛋白在牛膝醇提物对AMPK/Wnt/MAPK信号通路网络互作之间的联系起到了关键桥接蛋白作用，对证实牛膝治疗膝骨关节炎具有重要的基础理论意义，但具体的作用位点还需要深入研究。