小檗碱对乌拉坦诱导的肺癌模型小鼠PI3K/AKT信号通路的作用研究

谢育霞，姚志雪，黄文绯，曹罗元

（1.宁德师范学院附属宁德市医院，福建 宁德 352100；2.宁德市闽东医院，福建 宁德 352000）

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其发病率和死亡率均高，其中85%的患者患有非小细胞肺癌[1]。肺癌的常规治疗方法以手术、放射治疗、化疗和支持性护理（包括临终护理）为主，多数患者的预后和生活质量较差，术后肿瘤复发率及转移率高，易产生多药耐药，寻找新的预防和治疗肺癌的药物是当前肺癌临床治疗亟待解决的关键问题[2-3]。小檗碱是中药黄连的主要有效成分，研究证明，黄连除了具有抗菌、抗炎作用外，同时具有显著的抗癌作用，对肝癌、结肠癌、食管癌、白血病等多种恶性肿瘤有抑制作用[4]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinase B，Akt）信号通路与肿瘤细胞的生长繁殖、代谢和机体免疫应答有着紧密的联系，调节该信号通路关键蛋白的表达可能成为治疗肿瘤的新途径[5]。本研究采用乌拉坦诱导小鼠肺癌模型，以PI3K/AKT信号通路为切入点探究小檗碱对乌拉坦诱导的肺癌预防作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物6～8周龄SPF级ICR小鼠120只，雌雄各半，体质量（20±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证号：SCXK（京）2017-0011。实验小鼠在标准实验室内饲养，饲养条件：室温（22±2）℃，湿度（50±10）%，每天定时换气，保持12 h∶2 h光暗照明，食水不限。取血后麻醉处死全部实验小鼠。此实验经医学实验动物管理委员会批准，批准号：NDSYY-2018043。

1.2 药物与试剂 小檗碱（上海一基实业有限公司，纯度＞98%，批号：2086-83-1）；顺铂（批号：P4394）、乌拉坦（批号：P4394、U2500）（Sigma-Aldrich）；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（批号：G1121）、中性树胶（批号：G8590）、DAB显色试剂盒（批号：DA1010）（北京索莱宝科技有限公司）；蛋白定量试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，批号：BCA01）；癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）ELISA试剂盒（批号：E-EL-M0232c）、癌抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）ELISA试剂盒（批号：E-EL-H0636c）（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）；N-cadherin兔源单克隆抗体（批号：13116）、E-cadherin兔源单克隆抗体（批号：14472）、PI3K兔源单克隆抗体（批号：4249）、AKT兔源单克隆抗体（批号：4685）、磷酸化AKT（phospho-AKT，p-AKT）兔源单克隆抗体（批号：4060）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源单克隆抗体（批号：5174）、羊抗兔二抗（批号：7074）（美国CST公司）。

1.3 主要仪器YLS-1A型多功能小鼠自主活动记录仪（安徽正华生物仪器设备有限公司）；AE223型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；RM2245型切片机（德国徕卡）；DYCZ-24KS型双板垂直电泳仪（北京六一仪器厂）；G:BOX型多功能凝胶成像系统（Syngene）；Multiskan MK3型酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；IX53型显微镜（日本奥林巴斯）；TGL16MB型高速冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）。

1.4 造模与分组 将小鼠随机分为空白组，模型组，顺铂组和小檗碱高、中、低剂量组，每组20只。除空白组外，其余各组小鼠给予乌拉坦溶液（600 mg/kg）腹腔注射，每周注射1次，持续10周，造模结束后通过直接观察肺组织形态及肺组织病理切片确定造模是否成功，若肺组织表面出现明显的肿瘤结节或肺组织HE染色切片出现明显的核浓染、细胞密集增生及瘤区存在，证明造模成功[6]。

1.5 实验给药 根据前期预实验结果，顺铂组小鼠腹腔注射2 mg/kg顺铂，每周3次，小檗碱高、中、低剂量组小鼠分别灌胃给予150、100、50 mg/（kg·d）的小檗碱，空白组和模型组小鼠灌胃给予等体积生理盐水，所有小鼠连续给药19周。

1.6 观察指标

1.6.1 生理指标记录与样本采集 实验期间记录各组小鼠的体质量、自主活动情况（使用小动物自主活动仪测出的5 min内小鼠的活动次数），每两周1次。给药至第19周时，对小鼠摘眼球取血，血清在4℃冰箱中静置2 h，3 000 r/min离心10 min，置-80℃环境中保存；取小鼠肺组织，生理盐水清洗至无血丝，计算肺癌发生率和肺部肿瘤结节数并取平均值（肺癌发生率=荷瘤鼠数/检测鼠数×100%；肺部肿瘤结节数=检测鼠肺结节数总和/检测鼠数）。

1.6.2 HE染色检测肺组织病理变化 取小鼠肺组织，置4%多聚甲醛中固定48h，清洗后置于不同浓度的酒精中梯度脱水、制作肺组织蜡块并作组织切片（厚度为4 μm）。组织切片置于载玻片上，使用试剂盒进行HE染色，封片后置于显微镜下观察肺组织病理变化情况。

1.6.3 ELISA法检测血清CEA和CA125含量 取待测血清加入反应孔，每孔100 μL，每组设4个复孔，37℃孵育90 min，弃掉孔内液体，加入100 μL生物素化抗体工作液，37℃孵育60 min，弃掉孔内液体，洗涤3次，加入100 μL酶结合物工作液，37℃孵育30 min后弃掉孔内液体，洗涤5次，加入90 μL底物溶液，37℃孵育15 min，加50 μL终止液，450 nm波长下检测，按照标准曲线计算各组小鼠血清CEA、CA125的含量。

1.6.4 免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平 肺组织样本的采集和病理切片的制作同“1.6.2”。肺组织切片在二甲苯中脱蜡，置于梯度浓度的乙醇溶液中复水，随后进行修复抗原、封闭、4℃孵育一抗12 h，37℃孵育二抗0.5 h，冲洗后加DAB显色液，苏木精染细胞核，最后脱水、封片，置于显微镜下观察。

1.6.5 免疫印迹法（Western blotting，WB）检测PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平 将小鼠肺组织剪碎后冰上研磨，离心取沉淀，沉淀中加入裂解液，提取肺组织蛋白，测定蛋白的浓度，随后进行凝胶电泳，转膜、封闭后置于PI3K（1∶1 000）、AKT（1∶2 000）和p-AKT（1∶1 000）兔源一抗稀释液中，4℃环境下孵育12 h，第2天用TBST缓冲液清洗，37℃环境下加入羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育2 h，清洗后用加ECL发光液，置于凝胶成像系统显影。免疫印迹实验的内参蛋白为GAPDH，用Image J软件分析各个蛋白对应的灰度值，计算蛋白的相对表达量，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.7 统计学方法 应用SPSS 25.0软件对实验数据进行统计分析，GraphPad Prism 8.0作图。计量资料以“均数±标准差”）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两样本比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠体质量比较6组小鼠的体质量均增加，模型组和顺铂组呈前期体质量增加，后期呈缓慢下降趋势；与模型组比较，小檗碱高、中、低剂量组小鼠体质量均增加，以小檗碱中剂量组的小鼠体质量增加最显著；除空白组外，其余各组小鼠的自主活动均呈下降趋势，与模型组比较，小檗碱中剂量组小鼠自主活动下降较少，趋于稳定，以上指标差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见图1～2）

图1 各组小鼠体质量比较±s，n=20）

图2 各组小鼠自主活动比较，n=20）

2.2 各组小鼠肺癌发生率和肺部肿瘤结节数比较 顺铂组和小檗碱高、中、低剂量组小鼠肺癌发生率和肺肿瘤结节数均低于模型组（P＜0.05）；小檗碱中、低剂量组小鼠肺癌发生率和肺肿瘤结节数均高于顺铂组（P＜0.05）；小檗碱高剂量组小鼠肺癌发生率和肺肿瘤结节数与顺铂组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

表1 各组小鼠肺癌发生率和肺肿瘤结节数比较

表1 各组小鼠肺癌发生率和肺肿瘤结节数比较

注：与模型组比较，aP＜0.05；与顺铂组比较，bP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）肺癌发生率（%）肺肿瘤结节数（个）空白组 20 - - -模型组 20 - 100 36.00±2.21顺铂组 20 2 33.12±1.45a 8.10±1.58a小檗碱高剂量组 20 150 32.25±1.02a 8.31±1.79a小檗碱中剂量组 20 100 45.36±1.22a b 15.66±2.08a b小檗碱低剂量组 20 50 63.67±1.51a b 19.14±2.07a b

2.3 各组小鼠肺组织病理学形态比较 空白组小鼠肺组织完好，无增生和炎症细胞浸润现象；模型组小鼠肺组织出现较多核浓染、细胞密集增生现象，肺组织肿胀，肺泡正常形态消失，存在大面积瘤区；顺铂组和小檗碱高、中、低剂量组小鼠肺组织形态有明显改善，肺组织结构基本清晰，较少出现细胞核密集增生和炎症细胞浸润情况，不同剂量小檗碱的作用呈明显剂量依赖性。（见图3）

图3 各组小鼠肺组织病理变化情况（HE，×400）

2.4 各组小鼠血清CEA和CA125含量比较 模型组小鼠血清CEA和CA125含量均高于空白组（P＜0.05）；顺铂组和小檗碱高、中、低剂量组小鼠血清CEA和CA125含量均低于模型组（P＜0.05），小檗碱中、低剂量组小鼠血清CEA和CA125含量均高于顺铂组（P＜0.05），小檗碱高剂量组小鼠血清CEA和CA125的含量与顺铂组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组小鼠血清CEA和CA125含量比较（x±s）

2.5 各组小鼠肺组织E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平比较 与空白组比较，模型组小鼠肺组织N-cadherin蛋白阳性细胞百分比明显升高（P＜0.05），E-cadherin蛋白阳性细胞百分比明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，顺铂组和小檗碱高、中、低剂量组小鼠肺组织N-cadherin蛋白阳性细胞百分比降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白阳性细胞百分比升高（P＜0.05），且呈明显剂量依赖性。与顺铂组比较，小檗碱中、低剂量组小鼠肺组织N-cadherin蛋白阳性细胞百分比升高（P＜0.05），E-cadherin蛋白阳性细胞百分比降低（P＜0.05）；小檗碱高剂量组小鼠肺组织N-cadherin和E-cadherin蛋白阳性细胞百分比与顺铂组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表3、图4）

图4 各组小鼠肺组织N-cadherin和E-cadherin蛋白表达水平比较（免疫组化，×400）

表3 各组小鼠肺组织N-cadherin和E-cadherin蛋白阳性细胞百分比比较s，%）

表3 各组小鼠肺组织N-cadherin和E-cadherin蛋白阳性细胞百分比比较s，%）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与顺铂组比较，cP＜0.05

组别 动物数（只） 给药剂量（mg/kg）N-cadherin E-cadherin空白组 20 - 5.36±1.12 71.15±4.27模型组 20 - 65.26±3.57a 8.27±1.21a顺铂组 20 2 10.19±1.56a b 63.24±3.96a b小檗碱高剂量组20 150 12.45±2.14a b 69.24±4.18a b小檗碱中剂量组20 100 26.77±2.89a b c 40.58±3.17a b c小檗碱低剂量组20 50 42.84±3.11a b c 21.91±1.93a b c

2.6 各组小鼠肺组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达比较 与空白组比较，模型组小鼠肺组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，顺铂组和小檗碱高、中、低剂量组小鼠肺组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量均降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性。小檗碱中、低剂量组小鼠肺组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量均高于顺铂组（P＜0.05）；小檗碱高剂量组小鼠肺组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量与顺铂组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见图5、表4）

图5 各组小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达Western blotting图

表4 各组小鼠肺组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量比较

表4 各组小鼠肺组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白相对表达量比较

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与顺铂组比较，cP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（mg/kg）PI3K AKT p-AKT空白组 20 - 0.18±0.04 0.15±0.06 0.16±0.05模型组 20 - 0.95±0.09a 0.98±0.10a 0.99±0.12a顺铂组 20 2 0.25±0.04a b 0.24±0.04a b 0.25±0.03a b小檗碱高剂量组20 150 0.26±0.07a b 0.26±0.06a b 0.29±0.04a b小檗碱中剂量组20 100 0.45±0.05a b c 0.43±0.05a b c 0.49±0.07a b c小檗碱低剂量组20 50 0.69±0.07a b c 0.82±0.09a b c 0.85±0.09a b c

3 讨 论

目前，肺癌是世界上最常见的癌症，恶性程度高、易转移、易产生耐药性，西医疗法可在一定程度上杀伤癌细胞，但其不良反应严重影响患者生存质量和预后，因此，寻找有效的肺癌预防与治疗药物是当前肺癌临床研究的关键[7-8]。研究显示，多种中药活性成分具有较好的抗肿瘤作用[9-12]。小檗碱是一种源于黄连的生物碱，已有多项研究证明小檗碱具有显著的抗癌活性，然而小檗碱对乌拉坦诱导的小鼠肺癌的作用及机制仍有待阐明[13-14]。

本研究建立了乌拉坦诱导小鼠肺癌模型，结果显示，与模型组比较，小檗碱可显著改善肺癌小鼠的生存质量，降低乌拉坦诱导的小鼠肺癌发生率和肺部肿瘤结节数。其中，模型组，顺铂组和小檗碱高、低剂量组小鼠出现饮食减少，毛色无光泽，精神萎靡，自主活动下降的情况，而小檗碱中剂量组未出现此类现象，可能的原因是中剂量小檗碱为小鼠能够适应的最佳治疗剂量，在该剂量下，小鼠的生存质量最佳，肺癌发生率和肺肿瘤结节数能够被显著降低。肺组织病理切片结果显示，小鼠肺组织结构基本清晰，较少产生核浓染、核畸变等癌变现象，血清CEA、CA125的含量显著降低，且高剂量小檗碱作用与顺铂比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明小檗碱可抑制乌拉坦的诱癌作用。上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程为肿瘤发生侵袭和迁移的一个特征，出现EMT转化之后肿瘤细胞往往发生原位扩散，侵袭进入淋巴管和血管进而出现远端转移[15]。本研究结果显示，小檗碱可显著减少肺组织中N-cadherin蛋白表达水平，增加E-cadherin蛋白表达水平，抑制乌拉坦诱导肺癌EMT过程，其作用呈显著剂量依赖性，小檗碱高剂量组小鼠肺组织N-cadherin蛋白和E-cadherin蛋白相对表达量与顺铂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。这提示小檗碱具有良好的肺癌预防作用，可抑制肺癌的转移和侵袭。PI3K/AKT信号通路是一种密切参与到细胞生长繁殖、运动、代谢和免疫应答调节的信号通路，同样也参与到了多种疾病的发生与发展过程中，几乎所有人类和动物肿瘤疾病中均发现了其被活化的现象[16-17]。PI3K/Akt信号通路主要通过其上游和下游的诸多分子来调控多种细胞生物过程，如PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/NF-κB等信号通路已被证明与肿瘤的增殖侵袭密切相关[18]。MENG X等[19]研究发现阿帕替尼通过干扰PI3K/Akt/mTOR信号通路可以诱导凋亡和自噬，从而可以作为治疗难治性甲状腺乳头状癌的潜在治疗靶点。DUAN Y F等[20]通过体内、体外实验研究发现岩藻聚糖可通过抑制PI3K/Akt相关蛋白的磷酸化产生对肝癌的抵抗作用。与上述研究一致，本研究结果显示，与空白组比较，模型组小鼠肺组织PI3K/AKT信号通路被激活，PI3K、AKT、p-AKT的表达被显著上调，而小檗碱则可显著降低肺癌小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表达，呈剂量依赖性，小檗碱高剂量组与顺铂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），表明小檗碱可抑制肺癌小鼠PI3K/AKT信号通路的活化。

综上所述，小檗碱能够改善乌拉坦诱导的肺癌模型小鼠生存质量和肺组织病理变化，降低肺癌小鼠血清肿瘤标志物CEA、CA125水平，抑制肺癌EMT过程，其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路的活化有关。