罗汉果质量标准提高研究*

张 萌，黄华花，陈景海，吕诗诗

（1.厦门医学院药学系/厦门市中药生物工程重点实验室/福建省中药精加工与健康产品开发重点研究室，福建 厦门 361023；2.厦门大学附属妇女儿童医院/厦门市妇幼保健院，福建 厦门 361003）

罗汉果为葫芦科植物罗汉果[Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang]的干燥果实。罗汉果是一种传统中药，应用历史悠久，是首批被国家卫生部公布的药食两用中药材。罗汉果中含有皂苷、黄酮和多糖等成分，研究表明罗汉果皂苷具有调节血糖[1]、止咳祛痰[2]、润肠通便[3]、抗炎[3]、抗过敏[4]、提高免疫[5-6]等作用，罗汉果黄酮具有抑菌[7-8]、调节血糖[9]、抗疲劳[10]等作用，罗汉果多糖具有抗氧化作用[11]。因此，罗汉果皂苷和黄酮为罗汉果的主要活性成分。

目前关于罗汉果质量控制研究情况如下：《中华人民共和国药典》（2015年版）一部收载的该药材的质量标准[12]、张彦东等[13]建立的该药材配方颗粒的质量标准和屠寒等[14]研究的罗汉果复方制剂质量标准中均仅检测了罗汉果苷V；钟名诚等[14-15]建立的该药材质量标准中增加了多糖、总糖的含量测定。由此可见，罗汉果的质量控制存在着检测指标单一、专属性不强的问题。故本研究拟在现有研究[15-16]基础上，以黄酮、皂苷类成分为指标，建立多成分的定量和定性方法，使罗汉果的质量标准得到完善和提高，有利于对其质量进行有效地控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters Acquity型UPLC仪（美国Waters公司）；BS224S型、CPA225D型电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；WD-9403C型紫外仪（北京市六一仪器厂）。

1.2 试药与试剂 11批罗汉果样品信息见表1。罗汉果黄素（批号：181227）、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷（批号：190319）、罗汉果皂苷V（批号：190126）纯度均＞98%，均购自上海融禾医药科技有限公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别 取罗汉果粉末1 g，加水50 mL，超声（40 kHz，900 W）提取30 min，滤过，取滤液20 mL，加正丁醇萃取2次，每次20 mL，得正丁醇液，合并，回收，残渣以1 mL甲醇复溶，作为供试品溶液。另取罗汉果皂苷V、罗汉果黄素和山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷对照品，分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（TLC）2015年版《中华人民共和国药典》[16-17]操作，吸取上述4种溶液各2 μL，点于同一硅胶G板上，以正丁醇-乙醇-水（8∶2∶3）为展开剂，展开，晾干，喷以5%AlCl3乙醇液，105 ℃加热1 min，紫外光365 nm下检视。结果供试品色谱中，在与罗汉果黄素和山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图1A；再喷以2%香草醛溶液（以10%硫酸乙醇为溶剂），加热至斑点显色清晰，再检视，结果供试品色谱中，在与罗汉果皂苷V对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图1B。

图1 TLC 色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱及流速见表2；柱温：35 ℃；检测波长：203 nm；进样量：5 μL。

表2 流动相梯度洗脱及流速表

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别取罗汉果黄素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷和罗汉果皂苷V对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解并制成质量浓度分别为0.047 2、0.032 9、1.342 0 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取罗汉果粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，称定质量，超声（40 kHz，900 W）提取30 min，放冷，补足质量，摇匀，滤过，即得。

2.2.4 系统适用性试验 取上述混合对照品溶液、供试品溶液按上述色谱条件进样分析，记录色谱图（见图2）。结果3个成分的理论塔板数均不低于5 000，分离度均大于1.5。

图2 UPLC 色谱图

2.2.5 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液1.3、2.5、5.0、7.5、10.0 μL，按上述色谱条件进样分析，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X，mg/mL）进行回归分析，结果见表3。

表3 3 个成分标准曲线及线性范围

2.2.6 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次。结果罗汉果黄素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷和罗汉果皂苷V峰面积的RSD分别为0.69%、0.91%、0.69%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性考察 取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按上述色谱条件进样分析。结果罗汉果黄素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷和罗汉果皂苷V含量的RSD分别为1.81%、1.32%、1.50%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 重复性考察 取同一批号供试品，共6份，分别按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件进样分析。结果罗汉果黄素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷和罗汉果皂苷V含量的RSD分别为1.83%、2.07%、1.77%，表明本法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的供试品（批号：190401）6份各0.5 g，精密称定，分别加入一定量的混合对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件进样分析。结果见表4。

表4 3 个成分的加样回收率试验（n=6）

续表4：

2.2.10 含量测定 取11批罗汉果样品，按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，每批样品平行制备3份。按上述色谱方法进样分析。（见表5）

表5 11 批样品中3 个成分的含量（n=3，mg/g）

3 讨 论

3.1 测定指标的选择 罗汉果中罗汉果皂苷包括11-O-罗汉果苷V、罗汉果苷V、赛门苷I、罗汉果苷IV等[17-18]，罗汉黄酮主要包含黄酮苷元山奈酚和槲皮素[19]，黄酮苷槲皮素-3-Oβ-D-吡喃葡萄苷-7-O-α-L-鼠李糖苷、罗汉果黄素和山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷等[15-16，20]。因此本试验将罗汉果苷V、罗汉果黄素和山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷作为测定指标，评价罗汉果中皂苷、黄酮类成分的含量，能更全面综合地评价罗汉果的质量。

3.2 薄层色谱条件的考察 参照《中华人民共和国药典》（2015年版）一部罗汉果鉴别项下方法[11]进行试验，结果仅罗汉果皂苷V斑点清晰。考虑到罗汉果黄素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷具有较大的紫外吸收，故优化检视条件，即先喷以5%AlCl3乙醇液，加热后紫外365 nm下检视，结果罗汉果黄素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷斑点清晰，分离度好，再喷以2%香草醛溶液（以10%硫酸乙醇为溶剂），加热后日光下再检视，罗汉果皂苷V斑点清晰，分离度好，故确定该条件为最终的薄层色谱条件。

3.3 液相色谱条件的考察 采用UPLC法较普通HPLC法更节约时间，溶剂消耗量更少；考察了多种流动相系统，发现以乙腈-0.2%磷酸为流动相，所得色谱峰形好且稳定；通过PDA的全波长扫描发现，罗汉果黄素和山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷均在210nm后有两处最大吸收，分别为264 nm和342 nm，而罗汉果皂苷V在220 nm后没有最大吸收，《中华人民共和国药典》（2015年版）一部收载的罗汉果质量标准[11]和张彦东等[13]建立的罗汉果配方颗粒质量标准中罗汉果皂苷V的含量测定均在203 nm下进行，故本试验尝试以203 nm作为检测波长，结果基线更平稳且3个成分的峰面积均较大，故将203 nm确定为最终的检测波长。

3.4 指标的限量标准建议 在确定的色谱条件下测得11批罗汉果药材中罗汉果黄素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷和罗汉果皂苷V的含量，分别在0.273 5～0.877 6、0.123 7～0.585 3、7.608 8～21.148 8 mg/g之间，差异较大，因此参考含量最低值，拟定本品中罗汉果黄素（C33H40O19）含量不得少于0.27 mg/g，山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷（C27H30O14）含量不得少于0.12 mg/g，罗汉果皂苷V（C60H102O29)含量不得少于7.61 mg/g。与《中华人民共和国药典》（2015年版）一部罗汉果质量标准比较，增加了罗汉果黄素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的含量限度，提高了罗汉果皂苷V的含量限度。

本试验建立了多成分的定量和定性方法，该方法简便、可靠，能有效地提高罗汉果的质量控制水平。