麒麟丸及其主要成分制何首乌对大鼠的长期肝毒性研究*

杨春燕，叶向锋，魏金锋，顾 磊，戴凯琴

（1.北京协和建昊医药技术开发有限责任公司，北京 100076；2.广东太安堂药业股份有限公司，上海 200080）

麒麟丸（国药准字Z10930034）为国家中药保护品种，具有补肾填精、益气养血的作用，主要治疗男子不育及女子不孕症。制何首乌是麒麟丸的主要成分之一，具有补肝肾、益精血、乌须发和强筋骨等功效，主要用于治疗血虚萎黄、眩晕耳鸣、须发早白及腰膝酸软等[1]。近年来关于何首乌及其制剂引起的不良反应日益增多，其主要临床表现为肝损伤，国内有关何首乌不良反应文献中肝损伤约占93.47%[2-4]。虽然何首乌经过加工炮制后其肝毒性能降低，达到去毒减毒的目的[5-6]，但是仍有研究发现制何首乌会引起不同程度的肝损伤[7]。麒麟丸治疗不孕不育已在临床上广泛使用，但关于其以制何首乌为主要成分的肝毒性却鲜有报道。因此，本研究拟采用SD大鼠90 d连续灌胃给予麒麟丸和制何首乌提取物，考察可能出现的肝脏毒性，以期为临床进一步合理、安全地应用麒麟丸提供参考和指导。

1 材 料

1.1 实验动物与饲料 6～7周龄SPF级SD大鼠150只，雌雄各半，雌鼠体质量154～177 g，雄鼠体质量151～173 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。实验动物设施持续保持屏障环境标准，室温（23.2±0.9）℃，相对湿度（62.5±4.1）%，最小换气次数15次/h，光照明∶黑暗=12 h∶12 h，整个饲养过程中保持动物饮食活动自由。本实验所用动物及相关处置符合动物福利的要求，实验开展前经过了北京协和建昊医药技术开发有限责任公司实验动物管理和使用委员会（IACUC）的审查批准，受理编号：SN13157-DC。SPF大鼠饲料由中国军事医学科学院动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK（军）2012-0003。

1.2 药物 麒麟丸（广东太安堂药业股份有限公司，批号：B20130704，规格：90 g/瓶）；制何首乌提取物（浸膏）（广东太安堂药业股份有限公司，批号：B20140508）；制何首乌按麒麟丸处方工艺单独提取浸膏，每克浸膏含大黄素0.52 mg，含二苯乙烯苷13.2 mg。

1.3 试剂 丙氨酸氨基转移酶（ALT/GPT）试剂盒（批号：140591）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST/GOT）试剂盒（批号：140531）、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（批号：140691）、尿素（UREA）试剂盒（批号：140631）、尿酸（UA）试剂盒（批号：130511）、总胆固醇（CHO）试剂盒（批号：131121）、甘油三酯（TG）试剂盒（批号：130711）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号：140551）、肌酸激酶（CK）试剂盒（批号：140561）、总蛋白（TP）试剂盒（批号：130491）、白蛋白（ALB）试剂盒（批号：140511）、肌酐（CRE）试剂盒（批号：130461）、葡萄糖（GLU）试剂盒（批号：130621）、总胆红素（TBIL）试剂盒（批号：AUZ1005）、血清钙（Ca）试剂盒（批号：140441）（美国贝克曼库尔特公司）；凝血酶原时间（PT）试剂盒、活化部分凝血活酶时间（APTT）试剂盒（法国思达高公司）；灭菌注射用水（山东齐都药业有限公司）。

1.4 主要仪器 电子天平（德国赛多利斯公司）；STA-4型半自动四通道血液凝固测定仪（法国STAGO公司）；显微镜（日本OLYMPUS公司）；COULTERAU480型全自动生化分析仪（美国BECKMAN公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组 将150只大鼠随机分为对照组，制何首乌提取物组和麒麟丸低、中、高剂量组，雌雄各半，每组30只。

2.2 制何首乌的制备 麒麟丸和制何首乌提取物所使用的药材制何首乌采用黑豆汁拌匀润透3～4 h，蒸制5～6 h后再保温焖润6～8 h，晾药后制得。

2.3 剂量设计 麒麟丸的临床拟用剂量为6 g/次，2～3次/d，每日剂量为12～18 g。按成人一般体质量以60 kg计，每日成人拟用剂量为200～300 mg/kg。实验中麒麟丸低、中、高剂量组大鼠给药量分别相当于临床成人每日最大剂量的6.7、13.3、26.7倍，即2 000、4 000、8 000 mg/kg。制何首乌提取物组按照麒麟丸高剂量组（8 000 mg/kg）所含制何首乌计算给药剂量，实验中制何首乌给药剂量354 mg/kg（0.18 mg/kg大黄素、4.67 mg/kg二苯乙烯苷）相当于临床成人每日服用麒麟丸最大剂量中所含制何首乌的26.7倍，折合成制何首乌生药量为8 g/kg。

2.4 给药和取材 麒麟丸低、中、高剂量组和制何首乌提取物组灌胃给予相应药物，大鼠给药体积均为2 mL/100 g，对照组大鼠灌胃给予等体积蒸馏水，连续给药90 d。给药结束时每组分别处死20只大鼠（雌雄各半），在给药结束后设恢复期30 d，30 d后处死各组剩余大鼠。全部大鼠腹腔注射2.0%戊巴比妥进行麻醉，腹主动脉取血后处死，进行解剖。肉眼检查组织器官有无异常，对肝脏进行称重，并计算肝脏指数=（肝脏质量/体质量）×100%。

2.5 一般情况观察 观察并记录各组大鼠的一般情况，包括外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸情况、进食状况、体质量及体温变化。

2.6 血液生化相关检查 各组大鼠腹主动脉取血后，进行血液生化指标检查，IFCC连续监测法检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）；双缩脲终点法检测总蛋白（TP）；溴甲酚绿终点法检测白蛋白（ALB）；计算法检测球蛋白（GLB）、白球比（A/G）；矾酸氧化法检测总胆红素（TBIL）；对硝基苯膦酸二钠连续监测法检测碱性磷酸酶（ALP）；乳酸基质连续监测法检测乳酸脱氢酶（LDH）；N-乙酰半胱氨酸连续监测法检测肌酸激酶（CK）；葡萄糖氧化酶终点法检测葡萄糖（GLU）；谷氨酸脱氢酶两点法检测尿素（UREA）；尿酸酶终点法检测尿酸（UA）；苦味酸两点法检测肌酐（CREA）；胆固醇氧化酶终点法检测总胆固醇（CHOL）；甘油磷酸氧化酶终点法检测甘油三酯（TG）。另取血样，磁珠法检测凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血酶原时间（APTT）。

2.7 组织病理学检查 用10%中性福尔马林固定，固定后逐级酒精脱水，石蜡包埋、切片。经苏木素-伊红染色，光镜下进行检查。

2.8 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠一般情况 整个实验期间，对照组，制何首乌提取物组和麒麟丸低、中、高剂量组大鼠的行为活动、外观体征、粪便及尿液等均未见异常。

3.2 各组大鼠体质量和大鼠摄食量比较 整个实验期间，各组雌、雄鼠的体质量均不断增长，制何首乌提取物组和麒麟丸低、中、高剂量组雌、雄鼠的体质量及摄食量与对照组比较，无明显差异。表明长期灌胃麒麟丸不会影响大鼠的体质量和摄食量。

3.3 各组大鼠肝脏指数比较 给药结束及恢复期结束时，制何首乌提取物组和麒麟丸低、中、高剂量组大鼠的肝脏指数与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠肝脏指数比较（，%）

表1 各组大鼠肝脏指数比较（，%）

3.4 各组大鼠肝功能指标比较 给药结束时，制何首乌提取物组和麒麟丸低、中、高剂量组雌鼠的血清生化指标与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。麒麟丸低剂量雄鼠的A/G明显低于对照组（P＜0.01）；麒麟丸中、高剂量组TBIL明显高于对照组（P＜0.05）；制何首乌提取物组和麒麟丸低、中、高剂量组雄鼠其余血清生化指标与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。恢复期结束时，制何首乌提取物组和麒麟丸低、中、高剂量组雌、雄鼠的血清生化指标与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。（见表2～3）

表2 各组雌鼠生化指标比较（）

表2 各组雌鼠生化指标比较（）

表3 各组雄鼠生化指标比较（）

表3 各组雄鼠生化指标比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

给药结束时，麒麟丸高剂量组雄鼠的APTT明显短于对照组（P＜0.05），制何首乌提取物组和麒麟丸低、中、高剂量组雌、雄鼠其余凝血指标与对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。恢复期结束时，制何首乌提取物组和麒麟丸低、中、高剂量组雌、雄鼠的各项凝血指标与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠鼠凝血指标比较（，s）

表4 各组大鼠鼠凝血指标比较（，s）

注：与对照组比较，aP＜0.05

3.5 各组大鼠肝组织病理学改变 给药结束时，与对照组比较，麒麟丸高剂量组和制何首乌提取物组大鼠的肝脏未见明显与给药相关的毒性病理改变；恢复期结束，麒麟丸高剂量组和制何首乌提取物组大鼠的肝脏未发现延迟或蓄积毒性病理改变。（见图1）

图1 各组大鼠肝脏病理切片图（HE，×20）

4 讨 论

麒麟丸是运用中医学“肾主生殖”的理论，在五子衍宗丸基础上研制的治疗不孕不育的中成药，目前在临床上用于治疗少弱精子症等男性不育疾病[8]。已有研究显示麒麟丸在增加患者的精子质量，优化睾丸内环境等方面具有较好的临床疗效和安全性[9-10]。涂灿等[11]对何首乌及其制剂的临床不合理用药方式进行分析发现，其不合理用药主要涉及三超用药、采用非传统用药方式和不恰当联合用药等方面。何首乌及其制剂肝损伤的临床表现主要是黄疸、乏力、尿黄和皮肤黄等，临床指标主要表现为ALT、AST水平升高[4]。有研究报道何首乌及制何首乌能抑制大鼠原代肝细胞的增殖，减少胆红素的摄取及胆汁排泄，从而诱导肝细胞损伤[12]。谢丽华等[13]发现何首乌醇提物能抑制肝药酶CYP1A2、CYP2E1、CYP3A1等亚型活性抑制，减慢机体代谢速度，增高血药浓度或引起蓄积，导致药物不良反应的发生，引起肝损伤。因此，本研究为探索麒麟丸和其所含制何首乌的毒性，故增加制何首乌提取物组。

本研究中，麒麟丸低、中、高剂量组及制何首乌提取物组总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、凝血酶原时间（PT）等反映了肝细胞蛋白合成代谢功能的正常；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）等也说明肝细胞未受到损伤；总胆红素（TBIL）等指标也反映肝脏排泄、分泌及解毒功能正常。同时病理组织也显示肝脏均未见明显损伤。

麒麟丸（2 000～8 000 mg/kg）及制何首乌提取物（354 mg/kg）长期应用对大鼠无明显肝脏毒性，可能与制何首乌的蒸制、焖润时间较长有关。何首乌经炮制后其毒性减少，但是炮制方法、时间对何首乌成分及肝毒性均有影响[14]。制何首乌为中药材何首乌的炮制加工品，有黑豆汁蒸制法和清蒸法，同时采用常压或高压蒸制[15]。王燕青等[16]对何首乌生品及不同炮制方法制备的炮制品进行急性毒性研究，发现小鼠灌胃何首乌不同炮制品水提物后主要急性毒性症状有腹泻、怠动、毛色不华，其对小鼠急性毒性强度依次为生品组＞黑豆煮组＞黑豆汁蒸6 h组＞隔水炖组＞清蒸组＞黑豆汁蒸18 h组。何首乌引起肝毒性的主要化合物可能为顺式二苯乙烯苷和大黄素-8-Oβ-D-葡萄糖苷[17-18]；而何首乌经黑豆蒸制后，对肝细胞的毒性降低，且潜在可能毒性成分顺式二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷含量也降低[19]。SD大鼠灌胃大黄素（12 mg/kg）60 d反复给药未见明确的肝毒性，肝脏未见肿大，肝脏指数未升高[20]，与本实验制何首乌提取物反复灌胃给药结果一致。

本次实验中发现，在给药结束时麒麟丸低剂量组雄鼠A/G较对照组低16.7%；麒麟丸中、高剂量组雄鼠TBIL水平较对照组均升高22.2%；这两项指标的变化均无剂量效应关系，且制何首乌提取物组雄鼠这两项指标基本与对照组一致，判断这两项指标变化无毒理学意义。本次研究中麒麟丸低、中、高剂量组及制何首乌提取物组的给药量分别相当于临床成人每日最大剂量的6.7、13.3、26.7倍，SD大鼠灌胃麒麟丸（2 000～8 000 mg/kg）以及制何首乌提取物（354 mg/kg）90 d反复给药对大鼠无明显肝脏毒性。麒麟丸临床剂量安全范围较大，为麒麟丸的临床应用提供了安全性实验依据。