汉黄芩素对糖尿病肾病大鼠的血糖及肾组织TLR4、NF-κBp65水平的影响*

2021-11-22 12:20侯亚莉郭菲菲贺明娟吴国琼
中医药导报 2021年4期
关键词:黄芩糖化批号

侯亚莉,梅 稳,郭菲菲,贺明娟,吴国琼,林 梅,李 莉

(1.武汉市第四医院,湖北 武汉 430032;2.华中科技大学同济医学院基础医学院,湖北 武汉 430030)

糖尿病肾病是糖尿病患者常见的并发症之一,如不及时进行干预治疗,可能发展为肾衰竭[1]。目前尚没有治疗糖尿病肾病的特效药物,临床上主要采用控制血糖等病因治疗及对症治疗,所以,对于糖尿病肾病的治疗药物研发仍是当前的临床工作重点。TLR/NF-κB信号通路是调节体内炎症信号传递的重要信号转导通路[2],近年来有学者发现其与糖尿病肾病的发病机制及疾病进展密切相关[3]。汉黄芩素是从黄芩等植物中提取、分离得到的单体化合物,具有抗炎、抗氧化等多种药理作用[4-5],研究报道其对糖尿病具有一定的治疗作用[6]。然而,汉黄芩素对糖尿病肾病大鼠的作用及机制,目前尚未见报道。本文通过研究汉黄芩素对糖尿病肾病大鼠的血糖及肾组织TLR/NF-κB信号通路的调节作用,以期为汉黄芩素的药理作用研究及糖尿病肾病的药物研发提供新的思路及参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄成年雄性SPF级SD大鼠90只,体质量(180±20)g,购买于华中科技大学实验动物中心,许可证号:SCXK(鄂)2016-0009,适应性喂养1周后进行实验,动物房温度(22±2)℃,湿度(50±10)%,实验中采用颈椎脱臼法处死大鼠。本研究的动物实验按照《实验动物管理条例》进行,严格遵循3R原则,且获得本院动物护理和使用委员会批准审核。

1.2 药物与试剂 汉黄芩素标准品(北京索莱宝科技有限公司,批号:SW8020,纯度>98%);尿蛋白定量试剂盒(批号:20190826)、糖化血红蛋白酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒(批号:20191015)(南京建成生物工程研究所);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(批号:P0012)、极超敏ECL化学发光试剂盒(批号:P0018FM)、RIPA蛋白裂解液(批号:P0013B)、SOD活性检测试剂盒(批号:S0103)、MDA检测试剂盒(批号:S0131M)、RNA提取试剂盒(批号:R0011)、cDNA第一链合成试剂盒(批号:D7168L)、TLR4兔多克隆抗体(批号:AF8187)、NF-κBp65兔多克隆抗体(批号:AF5243)、GAPDH抗体(批号:AF1186)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(批号:A0208)(上海碧云天生物科技有限公司);大鼠高脂饲料(普通饲料中置入10%猪油、2.5%胆固醇以及1%胆酸钠)(上海锐赛生物技术有限公司,批号:20190606)。

1.3 主要仪器 IX83荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯公司);Sigma 8K高速冷冻离心机(德国Sigma公司);K3酶标仪(赛默飞世尔科技公司);ChemiDoc XRS型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司);血糖仪(罗氏诊断产品有限公司)。

1.4 造模与分组 90只SD大鼠按照随机数字表法随机分为对照组,糖尿病肾病组,二甲双胍组及汉黄芩素低、中、高剂量组,每组15只。除对照组,其余大鼠给予高脂饲料喂养的同时腹腔注射给予大鼠STZ溶液,50 mg/只,连续5 d[7-8],以大鼠血糖大于11.1 mmol/L,血清BUN及SCr水平升高及肾组织发生病理学改变视为造模成功。对照组给予大鼠普通饲料并腹腔注射等量的生理盐水。

1.5 实验给药 汉黄芩素低、中、高剂量组大鼠参照文献方法[8],按照人给药剂量的6.3倍给药,灌胃给予大鼠50、100、200 mg/kg的汉黄芩素,二甲双胍组大鼠灌胃给予二甲双胍溶液,200 mg/kg,对照组及糖尿病肾病组大鼠灌胃给予等体积蒸馏水,1次/d,给药12周[8]。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠24 h尿量及尿蛋白量 所有大鼠末次给药24 h后,连续3 d收集24 h尿液,测定尿量,使用大鼠尿蛋白ELISA检测试剂盒测定各组大鼠24 h尿蛋白量。

1.6.2 空腹血糖、糖化血红蛋白、血清BUN及SCr水平 每组取6只大鼠,禁食12 h,尾静脉取血,使用血糖仪检测空腹血糖,眼眶静脉丛取血使用ELISA试剂盒检测大鼠糖化血红蛋白水平,腹主动脉取血用全自动生化分析仪检测血清BUN、SCr水平。

1.6.3 大鼠肾组织SOD活性及MDA水平的测定 大鼠处死后分离肾组织,使用生理盐水灌流清除血液,取肾组织样品,加入4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液进行研磨匀浆,4 ℃,3 500 r/min离心10 min,取上清液,使用ELISA试剂盒检测大鼠SOD活性及MDA水平。

1.6.4 大鼠肾组织病理学检查 每组取6只大鼠,切除肾脏,将一半肾脏于4%中性甲醛中固定12 h,在石蜡包埋机中包埋后切成5 μm厚的切片,然后行常规HE染色。

1.6.5 实时定量PCR检测大鼠肾组织TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA水平 每组取6只大鼠,使用Trizol从新鲜分离的大鼠肾组织中提纯总RNA,cDNA合成试剂盒获得第一链cDNA,用SYBR green SuperMix进行定量PCR反应,结果采用2-△△Ct法以GAPDH为内参,计算表达量。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.6.6 Western blotting检测大鼠肾组织TLR4、NF-κBp65蛋白表达水平 每组取6只大鼠肾组织,加入组织裂解液后匀浆,离心分离上清,使用10% SDS-PAGE电泳,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,使用5%脱脂干奶在4°C封闭1 h,然后经TLR4、NF-κBp65及GAPDH(1∶1 000稀释)抗体及山羊抗兔二抗(1∶2 000稀释)孵育,用化学发光试剂盒在凝胶成像仪中成像,以GAPDH为内参,使用ImageJ软件对条带进行定量分析。

1.7 统计学方法 应用统计学软件SPSS 26.0进行统计分析,计量资料用“均数±标准差”()表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠24 h尿量及尿蛋白量比较 与对照组比较,糖尿病肾病组大鼠24 h尿量明显降低(P<0.05),24 h尿蛋白量明显升高(P<0.05);与糖尿病肾病组比较,汉黄芩素低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠24 h尿量明显升高(P<0.05),24 h尿蛋白量明显降低(P<0.05)。(见图1)

图1 各组大鼠24 h 尿量及尿蛋白量比较(,n=15)

2.2 各组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平比较 与对照组比较,糖尿病肾病组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平均明显升高(P<0.05),提示造模成功;与糖尿病肾病组比较,汉黄芩素低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平均明显降低(P<0.05)。(见图2)

图2 各组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平(,n=6)

2.3 各组大鼠血清BUN及SCr水平比较 与对照组比较,糖尿病肾病组大鼠血清BUN及SCr水平明显升高(P<0.05),提示造模成功;与糖尿病肾病组比较,汉黄芩素低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠血清BUN及SCr水平明显降低(P<0.05)。(见图3)

图3 各组大鼠血清BUN 及SCr 水平(,n=6)

2.4 各组大鼠肾组织SOD活性及MDA水平比较 与对照组比较,糖尿病肾病组大鼠肾组织SOD活性明显降低(P<0.05),MDA水平明显升高(P<0.05);与糖尿病肾病组比较,汉黄芩素低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠肾组织SOD活性明显升高(P<0.05),MDA水平明显降低(P<0.05)。(见图4)

图4 各组大鼠肾组织SOD 活性及MDA 水平(,n=6)

2.5 各组大鼠肾组织病理学检查 对照组大鼠肾组织细胞结构正常,未见明显组织病理学变化;糖尿病肾病组大鼠肾小球萎缩,肾小管扩张,肾间质纤维化,并可见大量炎性细胞浸润及坏死细胞脱落;汉黄芩素组及二甲双胍组大鼠肾组织结构基本恢复,肾小管扩张减轻,偶见炎性细胞浸润及坏死细胞脱落。(见图5)

图5 各组大鼠肾组织病理学改变(HE,×200)

2.6 各组大鼠肾组织TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA水平比较 与对照组比较,糖尿病肾病组大鼠肾组织TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA水平均明显升高(P<0.05);与糖尿病肾病组比较,汉黄芩素低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠肾组织TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA水平均明显降低(P<0.05)。(见图6)

图6 各组大鼠肾组织TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA 水平(,n=6)

2.7 各组大鼠肾组织TLR4及NF-κBp65蛋白表达水平比较 与对照组比较,糖尿病肾病组大鼠肾组织TLR4、NF-κBp65蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与糖尿病肾病组比较,汉黄芩素低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠肾组织TLR4、NF-κBp65蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。(见图7)

图7 各组大鼠肾组织TLR4 及NF-κBp65 蛋白表达水平(,n=6)

3 讨 论

糖尿病肾病是由糖尿病引起的肾脏疾病,是糖尿病患者的常见并发症之一。糖尿病肾病的主要临床表现有少尿、蛋白尿、血肌酐升高等典型肾功能损害症状,其发病机制与遗传因素、肾脏血流动力学改变、糖代谢异常、高血压等多种因素有关[9-10]。糖尿病肾病若不及时进行干预,可能进展为终末期肾衰竭,需要进行透析治疗。目前对于糖尿病肾病的治疗,临床上主要采用控制血糖、血压等病因治疗的手段。

汉黄芩素是从唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi以及滇黄芩Scutellaria amoena C.H.Wright等植物的根中提取得到的单体化合物。现代研究表明[11-12],汉黄芩素具有抗肿瘤、抗氧化应激、扩血管及肺组织保护等多种药理作用。近年来有文献报道[6,13],汉黄芩素对糖尿病具有一定的治疗作用。侯亚莉等[6]发现汉黄芩素能够调节糖尿病大鼠血糖,改善糖尿病大鼠视网膜病变;刘洋等[13]发现汉黄芩素能够显著缓解链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的高血糖和低胰岛素血症。

TLR是机体组织细胞参与非特异性免疫的一类蛋白质分子,能够激活机体产生免疫细胞应答,并诱导机体炎症因子的产生,参与体内炎症信号的传递[14-15]。NF-κB是组织细胞参与炎症反应、免疫应答等过程的关键信号转导通路,并能够调节细胞对炎症因子、辐射、病毒等信号的应激反应[16-17]。然而TLR/NF-κB信号通路及相关蛋白的异常激活会引发自身免疫疾病、慢性炎症及肿瘤等多种疾病。任凌燕等[18]研究发现糖尿病肾病的发病机制与TLR/NF-κB信号通路的异常激活有关,抑制TLR/NF-κB信号通路能够改善糖尿病肾病小鼠的肾功能;张正菊等[19]研究发现大黄素能够缓解糖尿病小鼠的炎症损伤,其机制与抑制TLR/NF-κB信号通路有关。

在糖尿病肾病的发病机制中,血糖水平的升高通过影响线粒体呼吸链多种途径,使体内氧自由基生成增加,发生氧化应激损伤[20]。同时,血糖波动能够通过加重机体氧化应激反应,进而加速糖尿病肾病的发生发展,其中SOD及MDA水平是氧化应激反应活化的标志[21]。对于糖尿病肾病患者,由于其肾小球足细胞损伤,使肾小球滤过功能降低,导致尿量减小及尿蛋白升高等病理变化[22]。尿素是体内蛋白质的代谢产物,其主要经过肾脏排泄[23];肌酐作为肌肉代谢的主要产物,其同样经过肾脏排出体外[24];当肾功能下降,肾小球滤过率降低时,血清BUN及SCr则会明显升高,故BUN及SCr作为肾实质受损的重要标志,在评价肾功能方面具有重要意义[25]。糖化血红蛋白水平是反映近期3个月内机体血糖的平均水平,与空腹血糖检测相比,糖化血红蛋白则较好地反映出机体长期较为稳定的血糖水平,避免了应激状态及饮食因素的影响[26]。本实验通过建立糖尿病肾病大鼠模型,研究汉黄芩素对糖尿病肾病大鼠的作用及机制。结果表明,与糖尿病肾病组比较,汉黄芩素组大鼠24 h尿量及肾组织SOD活性明显升高,24 h尿蛋白量、空腹血糖、糖化血红蛋白水平、血清BUN水平及血清SCr水平、肾组织MDA水平明显降低,提示汉黄芩素能够改善糖尿病肾病大鼠的肾功能及氧化应激损伤,缓解糖尿病肾病的进展,同时,汉黄芩素组大鼠肾组织TLR4 mRNA、NF-κBp65 mRNA水平及TLR4、NF-κBp65蛋白表达水平均明显降低,提示汉黄芩素能够抑制糖尿病肾病大鼠体内TLR/NF-κB信号通路的异常激活,进而发挥其肾组织保护作用。可以看出,汉黄芩素对于糖尿病肾病大鼠的改善作用表现在血糖控制、肾功能改善及病理学恢复等多个方面。根据各个指标在糖尿病肾病发病中的特殊意义,推测汉黄芩素能够通过抑制糖尿病肾病大鼠肾组织TLR4、NF-κBp65蛋白表达水平,进而有效地控制了肾组织炎症反应通路的传递,阻止肾组织进一步氧化损伤,恢复肾小球形态及功能,从而发挥对糖尿病肾病的治疗作用。由于时间等因素的限制,本实验未能考虑汉黄芩素与临床常用的降血糖药物合用时对糖尿病肾病大鼠肾组织TLR/NF-κB信号通路及其上、下游相关蛋白的影响,拟在今后的研究中将对其进行深入探讨。

综上所述,汉黄芩素能够显著改善糖尿病肾病大鼠肾功能及血糖水平,减轻大鼠肾组织氧化应激损伤及病理学变化,其机制可能与调节TLR/NF-κB信号通路有关。

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