广西壮族女性人群STK11基因rs2019107和rs741765遗传多态性研究

凌永嫦，仇雯丽，王俊利，李妹燕

(1. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院，广西 百色 533000)

1 对象与方法

1.1 研究对象 随机选取2018—2019年在广西右江民族医学院附属医院健康体检中心进行健康体检的壮族正常女性共351例，平均年龄(51.56±8.85)岁，所研究人群各项临床检查和实验室指标均正常，且为长期居住在广西地区，无血缘关系，无恶性肿瘤、精神病、慢性病和自身免疫性疾病等。研究对象均经受试者签署知情同意书，并经右江民族医学院附属医院伦理委员会讨论批准。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采集研究对象的空腹静脉血5 ml于肝素抗凝管，使用深圳亚能公司DNA提取试剂盒提取研究外周血DNA，放置-80℃冰箱备用。

1.2.2 引物合成和基因型检测 引物是上海天昊遗传分析中心有限公司用在线Primer3 软件设计合成(见表1)。首先取1 μl DNA样本用11% agarose电进行质量检查以及浓度估计，然后根据估计的浓度将样本稀释到工作浓度5～10 ng/μl；接着用HotStar Taq(Qiagen公司)进行多重PCR，PCR反应体系(20 μl)：1xGC-I buffer(Takara公司)，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStarTaq polymerase (Qiagen公司) ，1 μl样本DNA和1 μl多重PCR引物。PCR循环：95℃ 2 min；11个循环(94℃ 20 s，65℃ 40 s，72℃ 1.5 min)；24个循环(94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 1.5 min)；72℃ 2 min。多重PCR产物纯化：在20 μl PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease Ⅰ酶，37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min进行多重PCR产物纯化。连接反应体系：10x连接缓冲液1 μl、高温连接酶0.25 μl、5′连接引物混合液(1 μM)0.4 μl，3′连接引物混合液(2 μM)0.4 μl、纯化后多重PCR产物 2 μl、ddH2O 6 μl 混匀。连接程序：38个循环(94℃ 1 min，56℃ 4 min)。接着取1 μl 稀释后的连接产物，与0.1 μl Liz500 size standard，9 μl Hi-Di混匀，95℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪，通过毛细管电泳鉴别连接产物。SNP分型用GeneMapper4.1(AppliedBiosystems，USA)软件来分析，最后用DNA测序法验证。该试验委托上海天昊遗传分析中心进行。

表1 rs2019107和rs741765位点的引物信息

1.3 不同人群的基因型和等位基因分布频率数据获取 从千人基因组计划数据库获取非洲、美国、北京汉族、日本、欧洲和印度正常女性人群的基因型和等位基因分布频率。

1.4 统计学方法 使用SPSS 24.0软件进行数据的统计分析，采用Hardy-Weinberg平衡定律(hardy-weinberg equilibrium，HWE)验证研究对象是否均有代表性，计数资料以百分率(%)表示。两组间基因型和等位基因分布差异比较用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rs2019107和rs741765基因分型 在广西壮族正常女性人群中，rs2019107和rs741765这两位点均存在TT、TC和 CC三种基因型。测序图谱见图1。

注：A～C为rs2019107的基因型TT、TC、CC；D～F为rs741765的基因型CC、CT、TT。

2.2 rs2019107和rs741765位点多态性的分布 本研究采用HWE遗传平衡定律检验样本的群体代表性，结果显示rs2019107和rs741765基因型均符合HWE遗传平衡(P>0.05)，表明本研究对象具有群体代表性。rs2019107和rs741765在广西壮族女性人群中的基因型和等位基因分布频率，rs2019107和rs741765均主要以基因型TC和等位基因T为主，见表2。

表2 rs2019107、rs741765在广西壮族正常女性人群的分布

2.3 不同人群rs2019107和rs741765的基因型和等位基因分布频率 将广西壮族正常女性人群与千人基因组数据库中不同地区正常女性人群(包括非洲、美国、北京汉族、日本、欧洲、印度)进行基因型和等位基因的分布频率比较。结果表明:广西壮族正常女性rs2019107基因型分布频率与美国、欧洲和印度正常女性人群分布频率差异有统计学意义(P<0.05)，而与非洲、北京汉族和日本正常女性人群分布频率差异无统计学意义(P>0.05)；其等位基因与欧洲正常女性人群分布频率差异有统计学意义(P<0.05)。广西壮族正常女性人群的rs741765的基因型分布频率与非洲、美国、北京汉族、欧洲和印度正常女性人群分布频率差异有统计学意义(P<0.05)，而与日本正常女性人群分布频率无统计学意义(P>0.05)；其等位基因与非洲、美国、欧洲和印度正常女性人群分布频率差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3、表4。

表3 rs2019107在不同女性人群的分布频率

表4 rs741765在不同女性人群的分布频率

3 讨论

丝氨酸/苏氨酸激酶11 (STK11)是肿瘤抑制基因，在调节细胞生长和细胞凋亡中起关键作用，且参与细胞周期进展和代谢、细胞极性和迁移，以及染色质重塑等，因此，又被称为多任务激酶。STK11/AMPK 通路负向调节癌细胞增殖和代谢，并且还参与肿瘤侵袭和迁移，可作为癌症进展的重要标志[8]。Li J等[9]研究发现乳腺癌STK11表达水平明显降低，并参与乳腺癌的转移和侵袭。STK11在宫颈癌中发生了频繁的基因组改变，并发现该基因组改变指示宫颈癌患者预后较差[10]。一项Meta分析[11]表明，STK11基因与乳腺癌、卵巢癌发病风险相关。以上研究表明，STK11基因与女性恶性肿瘤，如宫颈癌、乳腺癌和卵巢癌等相关。单核苷酸多态性 (SNP) 存在于人类基因组的每200～300个碱基对中，可作为遗传标记[12]。除此之外，还对不同人群的疾病易感性存在差异。近年来，许多研究表明遗传多态性对疾病易感性起着重要的作用，可作为某些疾病的遗传标记和治疗效果的评价。目前鲜少见关于STK11基因多态性在广西壮族人群分布情况的文献报道。因此，本研究比较分析了STK11基因多态性位点rs2019017和rs741765的基因型和等位基因在不同地区人群中的分布差异，这有助于不同人群STK11基因突变与疾病易感性的探讨。

本研究结果显示，广西壮族正常女性人群 rs2019107基因型分布与美国人、欧洲人和印度人比较存在差异，而与北京汉族人之间的差异无统计学意义。这可能是广西和北京地域差异小，且属于同一种族，所以基因多态性差异性小；而广西与美国、欧洲、北京地域差异大，无明显亲缘关系，因此SNP存在明显的差异性。广西壮族正常女性人群rs741765的基因型和等位基因均与非洲、美国、欧洲和印度正常女性人群分布差异均有统计学意义，而与日本人的差异无统计学意义，可能由于日本与中国相邻，地域差异较小有关。此外，还与生活环境和习惯、人口流动、文化差异以及通婚状况有关。STK11基因位于人类染色体19p13.3上，据报道，rs741765位点多态性可能与结直肠癌易感性有关[13]。此外，Keshavarz P等[14]研究发现日本人群中的rs741765促进2型糖尿病发生发展，张娜娜等[15]也发现rs741765与陕西汉族人群2型糖尿病的发生相关；这可能与中国和日本相邻，地域差异小，以及相近的亲缘性相关。Bassols J等[16]研究发现西班牙白人的STK11的rs8111699与妊娠期糖尿病有关；而与沙特妇女的妊娠糖尿病无相关性[17]，表明STK11基因多态性位点存在遗传异质性。这些研究结果表明由于种族和遗传背景差异，基因多态性与疾病易感性可能存在差异性。

综上所述，不同地区人群STK11基因多态性位点rs2019107和rs741765的基因型和等位基因分布差异具有统计学意义，表明不同种族和地区由于遗传背景和文化环境的差异，对疾病易感性也存在差异。广西是G6PD缺乏症和地中海贫血的高发地区，本研究为今后研究STK11基因多态性与不同种族人群疾病易感性的关系提供理论基础。