二氢杨梅素对小鼠糖尿病心肌病的保护作用及机制研究*

陈 云，龚伟伟，钟素芬，孟国梁*

（南通大学药学院，南通 226001）

糖尿病（diabetes mellitus，DW）是一种常见的代谢性疾病,目前全世界成人DW 患者约4.63 亿,预计到2045 年将增至6.93 亿[1]。DW 患者长期高血糖会引发多种并发症,其中糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCW）是一种常见的心血管并发症,可出现独立于冠状动脉粥样硬化、高血压和其他心血管危险因素以外的心脏结构和功能异常,主要表现为心肌僵硬、心肌纤维化、肥厚,造成心脏舒张功能障碍和收缩功能受损[2],但尚缺乏行之有效的治疗方法。

二氢杨梅素（dihydromyricetin，DHY）是藤茶中含量最丰富的天然黄酮类化合物,具有多种药理学作用[3]。DHY 能提高果蝇应激耐受性,减缓肠道功能障碍,延长果蝇寿命[4]；促进自噬,减轻DW 肾间质纤维化[5]；抑制动脉粥样硬化斑块形成,促进脂质代谢,延缓载脂蛋白E 敲除小鼠的动脉粥样硬化进展[6],然而,DHY 能否保护DCW 尚不明确。本研究旨在探讨DHY 对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的小鼠DCW 的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 8 周龄雄性C57BL/6 小鼠购自南通大学实验动物中心（动物伦理编号:S20200323-095）。STZ购自美国Sigma-Aldrich 公司,DHY（纯度＞98%）购自西安天丰生物科技有限公司,羧甲基纤维素钠（carboxymethycellulose，CWC）购自中国医药集团上海化学试剂公司,去乙酰化酶3（sirtuin 3，SIRT3）抗体和受体相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DW 小鼠模型构建 小鼠禁食12 h,腹腔注射STZ 60 mg/（kg·d-1）,连续5 d,对照组（control 组）小鼠腹腔注射等量的枸橼酸盐缓冲液。尾静脉取血,利用One-Touch 血糖仪测定小鼠空腹血糖,＞16.7 mmol/L为DW 组。2 周后,小鼠予溶于0.5% CWC 的DHY 250 mg/（kg·d-1）灌胃,对照组予等量的0.5%CWC,持续12 周。实验期间每2 周定期测定小鼠空腹血糖。

1.2.2 糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）测定 小鼠眼球取血,1 000 r/min 离心10 min,沉淀即为红细胞。然后用生理盐水洗涤红细胞以制备溶血液,酸化后100 ℃加热水解1 h,加入蛋白沉淀剂涡旋混匀后,3 500 r/min 离心10 min,取上清,加入显色剂,40 ℃水浴保温30 min,冷却后于443 nm 处测吸光度值,计算HbA1c 含量。

1.2.3 超声心动图测定 小鼠用异氟烷（1%～2%）麻醉后,使用Visual Sonic Vevo 2100 型小动物超声成像系统经胸骨长轴视图检测心脏构型,使用W 型超声心动图记录图像,测量射血分数（ejection fraction，EF）和短轴缩短率（fraction shortening，FS）。取心尖四腔切面,多普勒取样容积置于二尖瓣下,声束与室间隔平行,获得心室舒张期E 峰和A 峰血流,计算舒张期E 峰与A 峰比值（E/A 值）。

1.2.4 丙二醛（malondialdehyde，WDA）测定 取30 mg心肌组织加入300 μL 磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）进行匀浆；4 ℃,12 000 r/min 离心10 min,弃沉淀,吸取上清备用。按说明书要求制备检测体系,利用酶标仪在532 nm 测定各样品吸光度值,根据标准曲线计算心肌组织WDA 水平。

1.2.5 总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测 取20 mg 心肌组织加入100 μL 预冷的PBS匀浆,4 ℃,12 000 r/min 离心5 min,吸取上清液备用。按说明书要求制备检测体系,利用酶标仪在593 nm处检测各孔吸光度值,根据标准曲线计算心肌组织T-AOC。

1.2.6 蛋白印迹（Western Blot）取左心室组织块30 mg,洗净吸干,加入300 μL 蛋白裂解液。剪碎组织块匀浆后,置于冰上裂解40 min。4 °C 12 000 r/min 离心15 min,取上清,BCA 法测定蛋白浓度,加入上样缓冲液煮沸5 min,保存备用。蛋白样品经十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,转移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脱脂牛奶封闭后,分别用SIRT3（1∶1 000）和RIPK3（1∶1 000）一抗4 °C 孵育过夜,换用二抗室温下孵育2 h。滴加增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显影液显像,Image J 分析条带灰度。

1.3 统计学方法 所有数据以平均值±标准误表示,使用Stata 13.0 软件,采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）及Bonferroni post hoc 检验进行比较,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DHY 对DW 小鼠空腹血糖和HbA1c 水平的作用 与control 组相比,小鼠腹腔注射STZ 后空腹血糖浓度均＞16.7 mmol/L,HbA1c 水平升高,提示成功构建DW 模型；DHY 治疗12 周后显著降低DW 小鼠空腹血糖和HbA1c 水平（图1）。

图1 DHY 对糖尿病小鼠血糖和HbA1c 的影响

2.2 DHY 对DW 小鼠心功能的影响 与control 组相比,DW 小鼠EF、FS 和E/A 均显著降低,提示DW小鼠心脏收缩和舒张功能障碍,出现典型的DCW 症状；DHY 治疗后显著增加EF、FS 和E/A,改善DW小鼠心脏收缩和舒张功能（图2）。

图2 DHY 对DW 小鼠心功能的影响

2.3 DHY 对DW 小鼠心肌氧化应激的影响 与control 组相比,DW 小鼠心肌WDA 水平显著升高,T-AOC 显著降低,提示DW 小鼠心肌组织氧化应激损伤加重；DHY 治疗后,小鼠心肌WDA 水平降低,T-AOC 升高,表明DHY 能减轻DW 小鼠心肌的氧化应激损伤（图3）。

图3 DHY 对DW 小鼠心肌氧化应激的影响

2.4 DHY 对DW 小鼠心肌SIRT3 和RIPK3 蛋白表达的作用 与control 组相比,DW 小鼠心肌SIRT3表达降低,RIPK3 表达升高；DHY 治疗后明显增加SIRT3 表达,抑制DW 小鼠心肌RIPK3 的表达（图4）。

图4 DHY 对DW 小鼠心肌SIRT3 和RIPK3 蛋白表达的影响

3 讨 论

STZ 是一个对胰岛β 细胞具有高度选择性的毒性物质,能干扰葡萄糖的转运,影响葡萄糖激酶的功能,促进胰岛细胞DNA 甲基化和DNA 链断裂,破坏胰岛β 细胞并导致胰岛素分泌不足,诱导产生DW[7]。DHY 是从显齿蛇葡萄茎和叶中分离出的一种黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保护心脏、清除自由基等作用[3]。值得注意的是,DHY 可激活小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞中的过氧化物酶体增殖物激活受体γ,改善胰岛素抵抗[8]；DHY 也可上调心肌组织中胰岛素受体底物-1 的磷酸化水平,改善（Lepr）KO/KO（db/db）小鼠的代谢紊乱和胰岛素抵抗[9],这可能也是本研究中DHY 抑制STZ 诱导DW 小鼠血糖浓度和HbA1c 水平,进而改善心功能的主要原因。

DHY 通过抗氧化作用发挥药理作用,比如DHY抑制氧化应激减轻HT22 细胞氧糖剥夺/复氧损伤[10],通过下调miR-34a 减轻高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化应激[11],减轻DW 小鼠胸主动脉氧化应激水平[12]。由于DW 患者持续的高血糖引起活性氧过量产生,从而在DCW 中发挥重要作用[13]。本研究发现DHY 降低DCW 小鼠心肌WDA 水平,T-AOC 升高,提示DHY 减弱DCW 小鼠心肌氧化应激水平,这可能是DHY 抗DCW 的重要机制之一。

DHY 抗氧化应激的确切机制尚不清楚。本课题组既往研究[12]发现,DHY 依赖增加血管组织中SIRT3表达进而减轻氧化应激,并改善DW 小鼠胸主动脉内皮依赖性舒张功能。SIRT3 是一种位于线粒体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性蛋白去乙酰化酶,调节线粒体呼吸、三磷酸腺苷合成、氧自由基生成及清除等过程。SIRT3 可通过调节叉头蛋白3a（forkhead-box-protein 3a，FOXO3a）和超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）等靶蛋白去乙酰化修饰,降低WDA,增强T-AOC,抑制体内的氧化应激水平[7，14]。相反,SIRT3 缺失可促进氧化应激,加重DW心肌损伤[7]。因此,DHY 增加DCW 小鼠心肌中SIRT3表达,可能是DHY 减轻氧化应激、改善DCW 的重要机制之一。

坏死性凋亡作为一种新近发现的可调控的细胞坏死,在心肌缺血再灌注、肺炎链球菌感染引起的心脏损伤、动脉粥样硬化等心血管疾病中发挥重要作用[15]。RIPK3 作为坏死性凋亡信号通路中的核心分子,表达增加是坏死性凋亡的重要标志之一[16]。RIPK3 升高后,磷酸化RIPK1,进而通过RIPK 同型相互作用基序相结合形成一种信号复合物,即坏死性小体,激活混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain like protein，WLKL）多个位点磷酸化,促进形成二硫键依赖的WLKL 聚合物,形成RIPK1-RIPK3-WLKL 复合物,然后转移至细胞膜并促使细胞破裂,驱动坏死性凋亡的执行[17]。有证据[18]表明,心肌细胞内蛋白质氧化和脂质损伤后过量产生的氧自由基可诱导心肌细胞坏死性凋亡；另一方面,坏死性凋亡又会促进氧自由基产生、加重细胞损伤[18]。本课题组既往研究[16]发现,高糖刺激上调心肌细胞RIPK3 表达,促进坏死性凋亡。本研究发现,DHY 降低DCW 小鼠心肌中RIPK3 表达,提示DHY抑制DW 心肌坏死性凋亡,这可能与DHY 减轻氧化应激密不可分,同时也会进一步减弱氧化损伤,形成良性循环,从而改善心功能。

综上所述,DHY 增加DW 小鼠心肌组织中SIRT3 表达,抑制氧化应激,减弱坏死性凋亡,增强心脏收缩和舒张功能,改善DCW,为DCW 防治提供了新思路,具有潜在的转化应用前景。