β-1，4-半乳糖基转移酶Ⅴ对脂多糖模型中iNOS、TNFR 表达的影响*

王小瑜，高书美，周 巧，金 会，惠美琦，严美娟*，沈洪妹*

（南通大学 教育部/江苏省神经再生重点实验室/神经再生协同创新中心，南通 226001）

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）来自革兰阴性菌细胞壁的一种非蛋白内毒素[1],是Toll 样受体4（Toll like receptor，TLR4）代表性配体,能引起免疫细胞激活,特别是小胶质细胞激活[2],促进诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达,释放肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等促炎因子[3]。小胶质细胞是中枢神经系统常驻和原发性免疫细胞,在神经炎症中发挥重要作用[4-5]。研究[6-7]表明,神经炎症成为神经损伤、神经退行性疾病、多发性硬化等疾病的致病因素,成为这些疾病的治疗靶向。但至今缺乏确实证据表明糖基化调控神经炎症。

糖基化是翻译后的一种重要修饰,决定蛋白质功能,在炎症、细胞黏附和内吞等重要过程中起着关键作用[8-9]。β-1，4-半乳糖基转移酶（β-1，4-galactosyltransferases，β-1，4-GalTs）家族由7 名成员组成（β-1，4-GalT Ⅰ～Ⅶ）[10],其中β-1，4-GalT Ⅴ是一种单链Ⅱ型跨膜蛋白,主要位于高尔基体,通过形成催化蛋白,参与蛋白糖基化修饰,调控β-1，4-半乳糖基转移酶N-酰基鞘氨醇（β-1，4-galactosyltransferase N-acylsphingosine，GlcNAc）链[11]。N.NAKAWURA 等[12]通过小鼠脑cDNA 克隆β-1，4-GalT Ⅴ,并发现其在产后表达增加。

本课题组前期实验[13]结果表明,β-1，4-GalT Ⅴ在脑组织中表达,参与创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）鼠的空间学习记忆恢复。因此,本研究将以LPS 刺激构建神经炎症模型,通过注射β-1，4-GalT Ⅴ干扰和过表达病毒颗粒,观察β-1，4-GalTⅤ对iNOS、肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）表达变化的影响。

1 材料与方法

1.1 病毒构建 β-1，4-GalT Ⅴ-RNA 干扰序列（TTCGGGACAACGTGAGGACCA）和对照序列（TTCTCCGAACGTGTCACGT）插入hU6-WCS-Ubiquitin-EGFPIRES-puromycin 质 粒Age1/EcoR1 位 点,β-1，4-GalT ⅤcDNA 和对照序列插入Ubi-WCS-3FLAGCBh-gcGFP-IRES-puromycin 质粒BamH1/Age1 位点。慢病毒颗粒采用HEK-293T 细胞包装,并进行效价测定,由上海吉凯基因化学技术有限公司进行。

1.2 病毒颗粒注射与LPS 模型构建 清洁级成年Sprague Dawley（SD）雄性大鼠（200～250 g）,腹腔注射10%水合氯醛（0.2～0.3 mL/100 g）进行麻醉。在大脑皮质上方进行双侧开颅手术,注射口位于前囟后方3.0 mm,矢状缝左右两侧3.0 mm,病毒注射深度为3.0 mm,注射速度为0.2 μL/min,注射时间5 min,共注射1 μL 慢病毒。病毒注射采用KOPF 脑立体定位仪Wodel 900、WPI 纳升显微注射泵Nanoliter 2010显微注射仪Wicro 4 进行。注射慢病毒3 d 后,腹腔注射LPS（0.5 mg/kg）建立LPS 动物模型。手术方案经南通大学实验动物伦理委员会批准（20180307-004）,操作遵循中国实验动物护理和使用指南。

1.3 组织免疫荧光染色 腹腔注射LPS 6 h 后,以10%水合氯醛0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉,剪开皮肤、胸腔,暴露心脏,生理盐水灌注后,进行4%多聚甲醛灌注。灌注后取脑组织,于4 %多聚甲醛中进行后固定24 h 后,于10%、20%、30%的蔗糖溶液中梯度脱水,组织沉淀后,进行冰冻切片,切片厚度为12 μm。室温下,切片用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗,封闭液37 ℃孵育1 h,一抗（鼠抗iNOS,1∶500；兔抗β-1，4-GalT Ⅴ,1∶500；Abcam 公司）于4 ℃孵育过夜,PBS 洗涤,荧光抗兔和鼠二抗室温孵育2 h。采用DWR 倒置Leica 显微镜采集图像。

1.4 免疫印迹 取100 mg 病毒注射部位组织置于5 mL 离心管中,加入300 μL 裂解液,超声波粉碎机粉碎组织,冰上裂解30 min,12 000 r/min,4 ℃离心20 min,收集上清。BCA 法检测上清蛋白浓度,并将蛋白浓度调整一致。按常规上样、电泳、转膜后,加入5%含吐温的Tris 盐酸缓冲盐溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）-BSA 中37 ℃封 闭2 h。加入一抗（兔抗TNFR1/TNFR2,1∶1 000,Proteintech 公司）4 ℃孵育过夜,TBST 洗膜后,辣根过氧化物酶连接的抗兔IgG（1∶1 000）孵育2 h,并使用增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显影液显像,以β-actin 为内参。

1.5 RNA 提取、逆转录及实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测 采用RNA 快速纯化试剂盒（ES Science 公司）,提取分离脑组织总RNA；采用逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific 公司）通过寡核苷酸（dT18）合成第一链cDNA。Light Cycler 96 和SYBR Green PCR Waster Wix（Roch 公司）进行RT-PCR 检测iNOS 基因表达水平。引物（iNOS:5′-AACCCAAGGTCTACGTTCAAG-3′,5′-AAAGTGGTAGCCATCCCG-3′；β-actin:5′-CAGTTCGCCATGGATGACGATATC-3′,5′-CACGCTCGGTCAGGATCTTCATG-3′）购于Thermo Fisher Scientific 公司,β-actin 作为内部对照,实验重复3 次。

1.6 统计学方法 每组实验数据均至少进行3 次独立实验,采用单因素方差分析和t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义,利用GraphPad Prism、Adobe Photoshop以及Image J 作为统计学分析和作图软件。

2 结 果

2.1 β-1，4-GalT Ⅴ对LPS 诱导后iNOS 表达的影响 采用组织免疫荧光染色,在LPS 腹腔注射动物皮层细胞胞质中发现β-1，4-GalT Ⅴ与iNOS 存在共定位（图1A）。采用RT-PCR 检测皮层中iNOS 表达水平,结果发现LPS 腹腔注射能明显增加皮层中iNOS的mRNA 水平,β-1，4-GalT Ⅴ敲减消除了LPS 刺激引起iNOS mRNA 水平增加,β-1，4-GalT Ⅴ表达增加却能加剧LPS 对iNOS mRNA 表达的影响（图1B）。

图1 β-1，4-GalT Ⅴ对LPS 诱导后iNOS 表达的影响

2.2 β-1，4-GalT Ⅴ对LPS 诱导后TNFR1 和TNFR2 表达的影响 采用免疫印迹,发现LPS 腹腔注射使脑组织中TNFR1 蛋白表达特异性增加,而β-1，4-GalT Ⅴ敲减能消除LPS 诱导的TNFR1 水平增加（图2A～B）。但是,无论是LPS 刺激还是β-1，4-GalTⅤ表达变化,都不能改变脑组织中TNFR2 蛋白表达（图2A、C）。

图2 β-1，4-GalT Ⅴ对LPS 诱导后TNFR1 和TNFR2 表达的影响

3 讨 论

β-1，4-GalT Ⅴ在脑组织表达,参与TBI 功能恢复[13]。研究[6-7]表明,神经炎症在TBI 中发挥重要作用,但β-1，4-GalT Ⅴ是否通过神经炎症实现其在TBI 的作用,至今没有实验证据支持。本研究以腹腔注射LPS 建立炎症模型,发现β-1，4-GalT Ⅴ与iNOS 共定位,参与LPS 刺激引起的iNOS 及TNFR1 表达增强。

LPS 是革兰阴性菌细胞壁的一种成分,通过TLR4 识别,激活免疫细胞,导致多种炎症介质表达增加,包括iNOS,以及促炎细胞因子,如TNF-α[14-16]。TNF-α 是一多效性细胞因子,通过两种不同的TNF特异性质膜定位受体,1 型TNF 受体（TNFR1,CD120 a）和2 型TNF 受体（TNFR2,CD120b）,参与多种病理生理过程,发挥多种生物学功能[17-18]。腹腔注射LPS,引起iNOS 表达增加,促进NO 的释放[19-20],TNFR1 表达特异性增加,但TNFR2 不受影响。因此,LPS 腹腔注射引起神经炎症反应,表现为皮层组织中iNOS 和TNFR1 表达增加。

β-1，4-GalT Ⅴ是一类重要的糖基转移酶,通过将UDP-半乳糖苷中的半乳糖苷基团转移到N-乙酰氨基葡萄糖中,形成半乳糖苷酶来实现蛋白质的糖基化β-1，4-半乳糖基转移酶N-酰基鞘氨醇（Gal β-1，4-GlcNAc）组[21]。组织免疫荧光染色结果表明,β-1，4-GalT Ⅴ在皮层组织表达,这和以往实验[13]发现Gal β-1，4-GlcNAc 组在皮层中表达相一致。本实验进一步发现,β-1，4-GalT Ⅴ和iNOS 存在共定位,敲减β-1，4-GalT Ⅴ使LPS 刺激引起的iNOS 表达增加消失,并特异性抑制LPS 刺激引起的TNFR1表达水平增加。因此,本研究提示β-1，4-GalT Ⅴ参与LPS 引起的神经炎症,影响LPS 模型中iNOS 及TNFR1 表达,但其影响的确切机制有待于进一步研究。