高活性蛹虫草菌株CMCX33子实体最佳采收时间研究

于婷婷，李力群，郝 捷，柴 颖

(内蒙古昆明卷烟有限责任公司，内蒙古 呼和浩特 010020)

蛹虫草(Cordycepsmilitarys)又名北虫草、北冬虫夏草，隶属于真菌界子囊菌亚门(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreales)麦角菌科(Clavicitaceae)，是我国一种兼具食用和药用珍贵价值的优质大型真菌[1-2]。研究表明，蛹虫草含有丰富的生物活性物质，如腺苷、虫草素、虫草酸、多糖、超氧化物歧化酶、蛋白质和氨基酸等，具有增强动物机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射、降血糖、降血脂、延缓衰老等功能，有很高的食药用价值[3-5]。腺苷、虫草素等核苷类是虫草中主要生理活性成分，且腺苷是虫草素的直接前体。研究发现，虫草素具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等功能，近年已成为虫草领域的研究热点之一；腺苷即腺嘌呤核苷，在生理代谢过程中起着调控作用，可用于治疗心绞痛、心肌梗塞、动脉硬化、原发性高血压及中风后遗症等病症，常用作虫草药材和深加工产品的质量检测指标。随着科技的进步，蛹虫草已实现规模化人工栽培, 使其资源的研究与开发在近几十年取得了很大进展, 逐渐成为野生资源不断减少、亟需保护的野生冬虫夏草的替代品，又因其具有极高的营养价值和保健功效,蛹虫草及其产品已被越来越多的消费者所接受, 特别是受到中国、日本和韩国等国家消费者的喜爱[6-9]。蛹虫草菌株CMCX33是具有较强虫草素、腺苷合成能力的高活性生产母种，子实体采收是其标准化、规模化人工栽培的重要环节，试验通过小规模人工栽培，考察了蛹虫草菌株CMCX33不同培养时间的子实体商品性状、生物学效率，并对不同培养时间子实体中虫草素、腺苷含量及收率进行比较分析，科学判定子实体最佳采收时间，为高活性蛹虫草菌株CMCX33标准化、规模化生产及合理控制子实体品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 供试蛹虫草菌株CordycepsmilitarysCMCX33由辽宁省微生物科学研究院药用蕈菌研究室提供。

1.1.2 培养基 ①液体菌种培养基(质量分数，%)：土豆20.00，葡萄糖2.00，硫酸镁0.05，磷酸二氢钾0.10，蛋白胨0.50，pH自然。②麦粒培养基：每盆装小麦粒450 g，按照1.0∶1.7的比例添加营养液(营养液：硫酸镁1.0 g，磷酸二氢钾2.0 g，维生素B15 mg，配制成1 000 mL 溶液，pH自然)。用聚丙烯膜包裹瓶口，并用橡皮筋扎紧，110 ℃保持6 h，冷却、备用。

1.1.3 主要试剂 葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素B1均为国产分析纯；乙腈为色谱纯，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；虫草素、腺苷标准品购自索莱宝生物公司，纯度≥98%。

1.1.4 仪器与设备 电子天平(AL204，梅特勒-托利多仪器有限公司)；中药粉碎机(HH30B，巩义市宏华仪器设备工贸有限公司)；高效液相色谱仪(Waters2695，美国waters公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9240A，上海一恒科技有限公司)；80目标准样筛(上海分样筛厂)；数控超声波仪(KQ-50DA，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 子实体培养 无菌挑取供试菌种新鲜斜面培养物3～4块(0.2 cm2/块)于液体培养基中，20 ℃、120 r/min培养4 d；无菌吸取培养液8～10 mL，均匀接种麦粒培养基上，18～20 ℃避光培养7～10 d，当培养基质表面长满白色菌丝后，24 h给予300 lx的光照，在培养温度20 ℃、空气相对湿度不低于50%、二氧化碳浓度不高于0.5%环境中进行原基诱导培养；当培养20 d左右，菌丝由白色变成均匀的橘黄色，且形成针尖状原基时，扎眼通气，进入子实体培养阶段；分别采收不同培养时间的子实体，备用。共进行3个批次的栽培试验，每个批次2 000盆(每盆培养料450 g)。

1.2.2 不同培养时间子实体商品性状观察及生物学效率测定 记录菌株CMCX33不同培养时间(35、45、55、60、65、70、75 d)子实体的色泽、高度、整齐度、长势，并按照下式计算子实体生物学效率：生物学效率(%)=(子实体鲜质量(g)/培养基干质量(g))×100%。

1.2.3 不同培养时间子实体虫草素、腺苷含量测定 参照农业部标准 NY/T 2116-2012(虫草制品中虫草素、腺苷的测定)方法进行含量测定。①虫草素、腺苷混合标准溶液的配制：分别精密称取虫草素、腺苷标准品各10.0 mg，去离子水溶解，流动相定容至100 mL，摇匀，即为混合标准品母液，虫草素及腺苷的质量浓度分别为100 μg/mL，4 ℃储存、备用。②色谱条件：色谱柱为ZOXBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；waters2489型二极管阵列检测器；柱温35 ℃；流动相：V水∶V乙腈=95∶5；流速1.0 mL/min；检测波长260 nm；进样量10 μL。③标准曲线制备：分别准确吸取虫草素、腺苷混合标准品母液0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、12.50 mL于25 mL容量瓶中，去离子水定容，摇匀，得到虫草素及腺苷的质量浓度分别为1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL；过0.22 μm微孔滤膜，供高效液相色谱进样分析。记录相应峰面积，分别以虫草素、腺苷的质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得出回归方程。④样品测定：分别取菌株CMCX33不同培养时间(35、45、55、60、65、70、75 d)的新鲜子实体，于55 ℃鼓风干燥至恒质量，粉碎，过80目筛，备用。准确称取待测样品粉末0.500 0 g，置于100 mL容量瓶中，加入去离子水80 mL超声波仪中超声提取3 h，去离子水定容，摇匀后，滤纸过滤，收集滤液，用针头过滤器过0.22 μm微孔滤膜，上样分析。每个样品3份平行样。以虫草素、腺苷标准品的保留时间定性，记录峰面积，根据标准曲线的回归方程计算样品液中腺苷、虫草素的质量浓度，按下式计算样品中腺苷、虫草素含量：样品活性物质含量(mg/g)=(样品液质量浓度(mg/mL)×样品液体积(mL))/样品质量(g)。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

由图1、图2可以看出，在选定的色谱条件下，样品与标准对照品在相同的保留时间内出现了虫草素、腺苷特征图谱；虫草素及腺苷在0～50.0 μg/mL范围内呈良好的线性关系，计算得腺苷回归方程：Y=30 213X+10 109(R2=0.999 7)；虫草素回归方程:Y=31 125X+14 250(R2=0.999 2)。

图1 标准品HPLC色谱图

图2 供试样品液HPLC色谱图

2.2 不同培养时间子实体商品性状观察及生物学效率测定

按照1.2.1的方法，对菌株CMCX33进行了3批次栽培试验，观察不同培养时间(35、45、55、60、65、70、75 d)子实体长势，并对生物学效率进行测定。结果(图3、图4)显示：培养35～65 d时，子实体均长势旺盛、色泽金黄、头部膨大、条形匀称，呈现良好的商品性状,随着培养时间的增加，子实体生物学效率明显提高，培养65 d时，生物学效率最高，达103.0%；随着培养时间的增加，子实体生长进入衰退期，子实体逐渐出现弯曲、根部变白、色泽变浅、发软易断等衰退现象，生物学效率呈明显下降趋势。可见，培养65 d菌株CMCX33的商品性状最佳、生物学效率最高。农艺性状是鉴别食用菌菌种的重要指标之一，而虫草素、腺苷是蛹虫草子实体中重要的活性物质，目前普通的栽培者只注重栽培产量，而忽略产品功能的重要性[10-12]。为更好地发挥蛹虫草保健功效，有必要对试验菌株子实体中的虫草素、腺苷含量、收率进一步考察，明确子实体生长过程中虫草素、腺苷含量和收率的变化规律，科学判定采收时间，对菌株CMCX33高品质栽培及高效利用具有重要指导意义。

图3 不同培养时间菌株CMCX33子实体长势

图4 不同培养时间菌株CMCX33的生物学效率

2.3 不同培养时间菌株CMCX33子实体中虫草素、腺苷含量测定

在对不同培养时间菌株CMCX33子实体商品性状及生物学效率考察基础上，对不同培养时间子实体中虫草素、腺苷含量进行了测定，并结合生物学效率，对不同培养时间子实体中虫草素、腺苷的收率进行了比较分析。结果(图5、图6)表明：在培养早期(35～55 d)，腺苷含量呈快速累积趋势，培养55 d时，腺苷含量达到较高水平(2.42 mg/g)，随着培养时间的增加，腺苷平均含量出现小幅度下降，腺苷含量趋于相对稳定，其收率随着生物学效率提高而增加，培养65 d时，腺苷收率最高(平均收率0.23%)；而虫草素含量呈先快速增加后减少的趋势，其中在培养早期(35～55 d)呈缓慢增加趋势，55～65 d为显著提升阶段，子实体中虫草素含量及收率增加幅度较大，培养65 d时，达到较高水平，平均含量达到4.40 mg/g，培养70 d时，子实体中虫草素含量达到峰值(平均含量4.79 mg/g)，但该时期子实体的生长进入衰退期，个别子实体变软，生物学效率有所下降，虫草素总收率与培养周期65 d的子实体相同(虫草素平均收率0.44%)。综合不同培养时间子实体商品性状、生物学效率、子实体中虫草素及虫草酸含量、收率等各因素，明确高活性蛹虫草菌株CMCX33在规模化生产中最佳采收时期为65 d。

图5 不同培养时间菌株CMCX33子实体中虫草素、腺苷含量

图6 不同培养时间菌株CMCX33子实体中虫草素、腺苷收率

3 讨 论

随着大健康产业的发展，人们生活水平不断提高，保健意识不断增强，对功能保健产品的需求量不断增加，极大地促进了蛹虫草子实体应用研究的发展。越来越多的蛹虫草生产企业在关注子实体产量的同时，对虫草素、腺苷等有效活性成分的含量提出更高要求。目前，有关通过优良菌种选育、优化培养条件及培养基配方等方法提高蛹虫草子实体中虫草素、腺苷含量的研究报道较多[13-15]，而对于蛹虫草菌株在人工培养过程中虫草素、腺苷含量变化规律的研究报道较少，探索、优化蛹虫草标准化栽培技术，依据子实体应用目的、农艺性状、主要活性成分含量变化趋势，科学选择子实体采收时间，是保障蛹虫草子实体品质、实现高品质生产的重要手段之一。

研究表明，试验范围内，不同培养周期的蛹虫草子实体中虫草素、腺苷含量及变化趋势存在明显差异，子实体的农艺性状、生物学效率在一定程度上影响上述成分的收率。试验通过对不同培养时间的高活性蛹虫草菌株CMCX33子实体农艺性状品质、生物学效率及虫草素、腺苷含量、收率的测定及差异化分析，明确了高活性蛹虫草菌株CMCX33最佳采收时期为65 d，为其应用研究及标准化栽培技术规程的建立提供参考。