一株蚯蚓肠道固氮菌的分离及鉴定

梁 珍，李林辉

(西华师范大学生命科学学院，四川 南充 637002)

氮素是土壤中利于植物生长的营养元素之一，氮素缺乏将会导致植物叶绿素、蛋白质、酶等化合物合成减少，抑制光合作用并影响植物生长[1]。土壤中可利用的氮素十分有限，不能最大限度满足作物的高产需求。施用化学氮肥是目前提高土壤含氮量最普遍的方法，但其过多的施用会导致地下及地表水污染，破坏河流生态环境，还会使得土壤酸化，导致土壤养分大量流失，除此之外还会通过反硝化作用增加N2O的量，加剧温室效应[2]。与施用化学氮肥相比，生物固氮的安全性及有效性更高，有利于土壤的安全性及农业的可持续发展[3]。目前生物固氮微生物类群很多，除了根瘤菌依赖于豆科作物外[4]，其他固氮菌的固氮能力严重依赖于环境条件，环境不适宜时，很难有预期的效果。然而动物肠道内环境稳定，如果有固氮能力，效果是可预期的。蚯蚓作为“土壤生态系统工程师”，不仅对土壤生物修复及物质循环有重要作用，其肠道独特的厌氧状态和丰富的营养物质也为厌氧和兼性厌氧菌提供了有利的微环境。有研究报道蚯蚓肠道内含有固氮菌[5]，但对其种类、固氮效果等鲜有报道。因此研究蚯蚓肠道固氮菌，对蚯蚓肠道内固氮微生物的开发与利用具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 蚯蚓来源 采集自西华师范大学校园。

1.1.2 培养基Ashby无氮培养基参考《一株固氮菌的筛选、鉴定及混菌发酵制备复合型菌糠菌肥的研究》[6]。

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓肠道固氮菌的分离 参考李森楠等人的操作方法[7]。略有改动，获得蚯蚓肠道内容物后将其接种于Ashby无氮培养基，25℃恒温培养，待长出菌落后，挑取生长最旺盛的单菌落继续纯化培养，共转接四次，最终获得一株纯化菌株，将其命名为006。

1.2.2 固氮菌的鉴定 形态学鉴定：在培养基中观察菌株菌落形态，并在显微镜下观察菌株菌体形态。

生理生化鉴定：对分离出的菌株进行革兰氏染色，运动性实验，接触酶实验，甲基红试验，含碳化合物(甘露醇，鼠李糖，麦芽糖，半乳糖)的利用试验，明胶液化实验，淀粉水解实验，葡萄糖发酵实验，纤维素分解实验[8]。

分子鉴定：提取分离菌株006全基因组DNA，以其为模板，用引物27F(5-’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增16SrDNA，用引物P1(5’-GGCTGCGATCCVAAGGCCGAYTCVACCCG-3‘)和P2(5’-CTGVGCCTTGTTYTCGCGGATSGGCATGGC-3’)扩增固氮酶nifH基因[9]。扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

固氮酶基因nifH检测：将引物P1、P2扩增到的产物测序结果在NCBI网站上进行比对。

固氮菌16SrDNA 片段序列分子系统学分析：将引物27F、1492R扩增到的产物测序结果在NCBI网站上进行比对，并选取相似度高的菌株以及同一菌群内知名度高的菌株作为参考菌株，用 MEGA 7.0构建系统发育建树，其分析方法采用邻接法(NJ)。

2 结果与分析

2.1 固氮菌的经典鉴定

形态学特征：细菌006在Ashby无氮培养基上生长良好，菌落呈圆形、白色、半透明、光滑、湿润、易挑取，光学显微镜下菌体呈短杆状，单个排列。

生理生化特性分析：见表1。

表1 生理生化特征分析

根据以上实验结果，结合《常见细菌系统鉴定手册》[8]，初步鉴定该菌属于克雷伯氏菌属。

2.2 nifH基因检测

以细菌006总DNA为模板，扩增nifh基因，扩增出大约300bp的片段，测序结果在NCBI网站上比对发现，该片段序列与Klebsiella sp. TD153S 固氮酶还原酶基因(nifH)相似性达100%，可以确定该菌含固氮酶nifH基因，该菌属于固氮菌。

2.3 固氮菌16SrDNA 片段序列分子系统学分析

用引物扩增固氮菌006 16SrDNA序列，扩增出1300bp左右的片段，测序结果在NCBI网站上比对发现，其与Klebsiella variicola(NR_025635.1)亲缘关系最近，其相似性为100%，结合形态学分析及生理生化特征分析， 将该固氮菌鉴定为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)。用 MEGA 7.0 软件构建系统发育树如图1所示。

图1 固氮菌16SrDNA系统进化树

3 讨论

蚯蚓作为生态系统中的分解者及消费者，与土壤密切相关，土壤为蚯蚓提供栖息地，而蚯蚓的日常活动改善土壤的结构、渗透性、能量流动和养分转化[10]。蚯蚓肠道菌在维持蚯蚓的新陈代谢、对环境中营养物质和污染物的转化方面发挥着关键作用[5]。Biswas等人从蚯蚓肠道中分离出的巨大芽孢杆菌菌株、地衣芽孢杆菌菌株和溶血葡萄球菌菌株能通过使重金属离子和磷酸盐形成复合物来降低Cu2+和Zn2+的毒性[11]。Huerta等人则发现蚯蚓肠道内含有可分解微塑料的细菌，如厚壁菌门细菌、芽孢杆菌和放线菌，它们通过将微塑料当做碳源来代谢低密度聚乙烯、聚丙烯和聚氯乙烯[12]，从而对微塑料污染物进行降解。而本文从校园土壤蚯蚓肠道中获得的固氮菌——变栖克雷伯氏菌，归属于变形菌门克雷伯氏菌属，兼性厌氧，具有固氮作用。该类细菌属于联合固氮菌，不仅在固氮方面发挥重要作用，在溶磷、解钾、生物防治、作为铁载体及环境污染物降解等方面都有重要作用[13]，并被广泛应用于甘蔗[14]、禾麦苗[15]的联合固氮中。此前也有从环境中分离得到变栖克雷伯氏菌[16]的例子，但环境的不稳定会对细菌的活力和联合固氮力有影响。本文的固氮菌是从蚯蚓肠道中分离得到的，我们验证了它的固氮能力并确定了它的分类学地位，为以后将固氮菌回植到蚯蚓肠道中，使其发挥稳定的固氮能力打下了基础。今后我们还需进一步探索变栖克雷伯氏菌的固氮能力以及将其回植到蚯蚓肠道内的可行性、最佳接种量、最佳接种条件等。