基于网络药理学、分子对接及实验探讨茵陈蒿汤调节阻塞性黄疸氧化应激的作用机制

陈帅，刘军舰，尚海涛，张井虹，李忠廉

（1.天津医科大学研究生院，天津300070；2.天津市中西医结合医院肝胆胰第二外科，天津300100）

阻塞性黄疸（obstructive jaundice，OJ）是指由胆道内或胆道邻近部位的良、恶性病变阻碍胆汁经由胆道流入十二指肠引发胆道内压力增高，胆汁由肝细胞和毛细胆管逆流入血窦、窦周，使血中结合胆红素水平升高引起的黄疸[1]。阻塞性黄疸可以引起机体发生炎症、内毒素血症、肝脏血流动力学改变、氧自由基增多等，从而造成肝损伤[2-3]。目前利用外科手段积极处理病因是西医治疗的首要方法，但中药方剂对保守治疗、术前减黄及解除梗阻后加快黄疸消退、改善肝功能有较大作用[4]。茵陈蒿汤由茵陈、大黄、栀子三味药组成，是治疗湿热黄疸的常用方。氧化应激是肝损伤病理过程中的一个重要因素，众多研究证实茵陈蒿汤可以改善OJ引起的肝损伤，但对其作用机制缺乏系统的研究。网络药理学能够系统观察药物对疾病网络的干预与影响，这与复方中药多成分、多途径和多靶点协同作用的原理殊途同归[5]。

1 材料与方法

1.1 茵陈蒿汤的有效成分及靶点的收集与筛选 通过TCMSP数据库搜索茵陈蒿汤中药物（茵陈、大黄、栀子）的化学成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为筛选标准，得到茵陈蒿汤的有效化学成分及其对应的靶点蛋白。

1.2 疾病靶点获取 通过Gene Cards数据库检索关键词“obstructive jaundice”，得到OJ的相关靶点。

1.3 茵陈蒿汤和OJ的靶点交集 运用Excel中VLOOKUP函数以及UniProt数据库对茵陈蒿汤中化学成分的靶点蛋白的基因名称进一步规范。利用R4.0.2软件将茵陈蒿汤的作用靶点与OJ的靶点进行交集分析，获得茵陈蒿汤和OJ的交集靶点，并绘制Venny图。并通过Cytoscape软件，对茵陈蒿汤中有效成分和交集靶点进行拓扑属性分析。

1.4 交集靶点蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）网络构建 将交集靶点导入STRING数据库，将蛋白种属设置为“Homo sapiens”，去除孤立的靶点蛋白，其余参数均保持默认，获得茵陈蒿汤与OJ交集靶点的蛋白相互作用关系网络数据。通过Cytoscape软件进行网络可视化及网络拓扑属性分析。

1.5 GO功能与KEGG通路富集分析 将Bioconductor数据库导入R软件，利用R软件对茵陈蒿汤与OJ的交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并将其结果绘制成柱状图与气泡图进行可视化。

1.6 分子对接验证 从TCMSP数据库中导出茵陈蒿汤主要成分的分子结构，保存为mol2格式，利用Autodock Tools4.2.6软件调整电荷、判定配体的root、选择配体可扭转的键，并保存为pdbqt格式。从PDB数据库中获得eNOS和iNOS的蛋白结构，通过PyMol2.4.1软件去除水分子及原配体，然后利用Autodock Tools给蛋白加氢、计算电荷、添加原子类型，并保存为pdbqt格式。再通过Autodock Tools获得活性位点中心及盒子大小等对接信息，默认设置为energy_range=3，exhaustiveness=100。最后运用Autodock-vina1.1.2执行分子对接计算，通过PyMol软件实现对接结果可视化，建立分子对接模式图。

1.7 免疫组化实验验证

1.7.1 药材、试剂 依据《伤寒论》中茵陈蒿汤剂量组成折合：茵陈180 g，栀子150 g，大黄60 g，共计390 g中药购于天津市南开医院中药制剂室，取2次煎煮液浓缩至390 mL，每mL含生药量1 g。

免疫组化试剂：4%多聚甲醛、多聚赖氨酸、抗原修复液、山羊血清封闭液、一抗：NOS3（A-9）:sc-376751，NOS2（C-11）:sc-7271（购自SANTA CRUZ生物公司）；二抗：IgG；辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP）；DAB显色试剂盒；苏木素等。

1.7.2 动物模型制备及分组给药 成年Sprauge-Dawley（SD）大鼠36只，体重200～230 g，雄性，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（实验动物使用许可证号：SCXK京2014-0004；动物伦理委员会通过编号：NKYY-DWLL-2019-081）。应用随机数字表法将大鼠分为假手术组（A组）、模型组（B组）、茵陈蒿汤组（C组），每组12只。B组和C组于大鼠胆总管中上1/3行双重结扎，手术3 d后观察大鼠小便颜色变黄即说明OJ模型建立成功。A组游离上段胆总管后关腹。大鼠自建模后第3天起C组每日给予茵陈蒿汤剂3.6 mL/kg（相当于生药1 g/mL）灌胃，A组和B组每日给予等量生理盐水灌胃。于术后10 d处死大鼠，并留取肝组织进行IHC检测。

1.7.3 免疫组化 取A组、B组、C组大鼠肝组织，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗，取少量组织块；用4%多聚甲醛进行固定，多级脱水、包埋成石蜡组织块，按5μm切片，附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜；将切片经二甲苯及多级乙醇脱蜡；放入抗原修复液、正常山羊血清封闭液，进行eNOS及iNOS免疫组化，最后加入DAB试剂和苏木素染色，显微镜下观察，进行400×的显微照相，选择有意义的组织相进一步分析。

1.7.4 统计学处理 实验结果采用SPSS26.0软件进行分析，采用单因素方差分析进行多组间比较，且符合方差齐性就采用LSD检验方法，实验结果以±s及柱状图表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 茵陈蒿汤有效成分筛选 通过在TCMSP数据库中检索，根据OB≥30%、DL≥0.18的标准进行筛选，获得44个有效成分。茵陈、大黄、栀子分别筛选到13、16、15种有效成分（表1），其中β-谷甾醇（beta-sitosterol）为茵陈、大黄、栀子三者的共有成分，槲皮素（quercetin）为茵陈和栀子的共有成分。

表1 茵陈蒿汤主要有效成分及相关参数Tab 1 Main effectivecomponentsand related parametersof Yinchenhao Decoction

2.2 茵陈蒿汤和OJ的靶点交集分析 将茵陈蒿汤中41个化学成分及其对应的靶点蛋白，运用Excel中VLOOKUP函数以及UniProt数据库剔除重复项并规范基因名称，得到29个化学成分及对应的177个靶点。通过在GeneCards数据库中检索OJ相关靶点，共得到2 183个疾病相关靶点。将茵陈蒿汤的作用靶点与OJ的靶点进行交集分析，得到123个交集靶点基因，如图1。将茵陈蒿汤化学成分和交集靶点导入Cytoscape软件进行网络拓扑属性分析，筛选出前5个主要化合成分，见表2。

表2 前5个与交集靶点对应的主要化合物Tab 2 The first five main compounds corresponding to the intersection targets

图1 茵陈蒿汤和OJ的交集靶点韦恩图Fig 1 Venny diagram of intersection target of Yinchenhao Decoction and OJ

2.3 交集靶点PPI网络构建 将交集靶点导入STRING数据库，获取蛋白互作信息（其中有1个蛋白未参与互作）。将蛋白互作信息导入到Cytoscape软件进行网络拓扑属性分析，得到茵陈蒿汤和OJ交集靶点PPI网络（图2）。在PPI网络中，一个节点的度（Degree）表示网络中和节点相连的路线条数，该网络由122个节点组成，其中节点的大小与Degree成正比，Degree越大颜色越红，表示靶点作用途径更多。根据节点的Degree绘制出前15个关键靶点的条形图（图3）。

2.4 GO功能与KEGG通路富集分析 为进一步探讨茵陈蒿汤作用于OJ的机制，对交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。根据P＜0.05，确定了135个GO条目和162个KEGG通路，分别将靶点富集个数前20的GO条目和KEGG通路绘制成条形图（图4）和气泡图（图5），并利用Cytoscape软件绘制主要通路-靶点-化合物的网络图（图6）。通过对图6分析发现靶点蛋白NOS3和NOS2参与氧化应激过程中的多条通路，并与茵陈蒿汤中多个化合物有关（图7）。

图4 茵陈蒿汤治疗OJ作用靶点的GO富集条形图Fig 4 Bar graph of GO enrichment of targetsof Yinchenhao Decoction in thetreatment of OJ

图5 茵陈蒿汤治疗OJ作用靶点的KEGG富集气泡图Fig 5 Bubblechart of KEGG enrichment of targetsof Yinchenhao Decoction in thetreatment of OJ

图6 主要通路-靶点-化合物网络Fig 6 Main pathway-target-compound network

图7 NOS2、NOS3相关化合物及通路网络Fig 7 Network of compoundsand pathwaysrelated to NOS2 and NOS3

2.5 分子对接验证 通过Autodock_vina软件将目的蛋白NOS3（eNOS）和NOS2（iNOS）分别与槲皮素、山奈酚、异鼠李素进行分子对接。分子对接结果示eNOS和iNOS与槲皮素、山奈酚、异鼠李素的最低结合能均<-5.0 kcal/mol（表3），且分子对接模式图中这些化学成分与eNOS和iNOS蛋白上多个氨基酸残基相结合（图8）。

图8 eNOS和iNOS与主要化合物的分子对接模式图Fig 8 Molecular docking patternsof eNOSand iNOSwith major compounds

表3 eNOS和iNOS与主要化合物的最低结合能（kcal/mol）Tab 3 The lowest binding energies of eNOSand iNOSwith major compounds（kcal/mol）

2.6 茵陈蒿汤对大鼠肝组织中NOS3（eNOS）和NOS2（iNOS）蛋白表达的影响 IHC结果显示：与假手术组相比，模型组肝组织中eNOS平均光密度值降低，而iNOS平均光密度值升高（P＜0.05）；与模型组相比，茵陈蒿汤组肝组织中eNOS平均光密度值升高，iNOS平均光密度值降低（P＜0.01），见图9、10。

图9 各组大鼠肝组织中eNOS和iNOS表达（免疫组化，400×）Fig 9 Expression of eNOSand iNOSin liver tissueof ratsin each group（IHC，400×）

图10 各组大鼠肝组织中eNOS、iNOS蛋白平均光密度值比较（±s）Fig 10 Comparison of the AODof eNOSand iNOSproteinsin liver tissueof ratsin each group（±s）

3 讨论

中医认为黄疸发病有湿、热、寒、血瘀、脾虚等多种不同的病机，其中以湿邪为主。辨证分型以湿热蕴结为常见，治疗均以化湿邪、利小便为治疗大法，对症选用清热利湿、温中补虚、化瘀等治法[6]。茵陈蒿汤由茵陈、大黄、栀子三味药组成，方中重用茵陈为君药，以其善能清热利湿退黄，为治黄疸之主药。臣以栀子清热降火，通利三焦，助茵陈引湿热从小便而去。佐以大黄泻热逐瘀，通利大便，导瘀热由大便而下。三药合用，以利湿与泄热相伍，使二便通利，前后分消，湿热得行，瘀热得下，则黄疸自退。

本研究通过网络药理学方法，获得茵陈蒿汤的41种有效化学成分，经过筛选规范，共收集到29个有效化学成分及对应的177个靶点，并对这些有效成分及靶点进行分析。槲皮素的作用靶点最多，它也是茵陈、栀子共有的化学成分；其次是山奈酚，以及异鼠李素、芦荟大黄素、β-谷甾醇等。研究表明，槲皮素是一种黄酮类化合物，具有多重生物活性，如抗氧化、抗炎、减轻肝毒性、预防肝纤维化等作用[7-8]。山奈酚是一种黄酮类化合物，通过发挥抗炎和抗氧化作用，在各种化学诱导的肝损伤模型中发挥保护作用[9]。另外，山奈酚可以降低谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平，减轻肝细胞损伤和凋亡[10]。β-谷甾醇在抗氧化、抗炎、免疫调节、抗肿瘤等方面表现出良好的药理作用[11]。此外，现代药理研究表明，茵陈蒿汤的茵陈色原酮、Artepillin A、芦荟大黄素等成分具有促进胆汁分泌和排泄的作用[11]。通过药物与疾病靶点交集得到123个交集靶点。其中蛋白激酶B（Akt）1、TP53、白细胞介素（IL）-6、血管内皮生长因子（VEGF）A、CASP3、肿瘤坏死因子（TNF）、Jun、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）8是关键靶点蛋白。AKT1基因编码的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与PI3K、EGFR等多个通路，在炎症、细胞增殖、迁移和纤维形成的肝损伤过程中起着独特的作用[13]。IL-6是一种多功能细胞因子，可以激活多种细胞内信号通路，在肝细胞凋亡、抗炎、氧化应激中起着重要作用[14-15]。VEGFA是具有高度内皮细胞特异性的有丝分裂原，在血管发生和形成过程中起着主要的调控作用。VEGF的表达可以促进血管形成，在肝脏再生和肝损伤的修复中起着重要作用[16]。

通过对交集靶点的GO富集结果分析，预测茵陈蒿汤治疗OJ可能涉及DNA结合转录因子结合、信号受体激活剂活性、细胞因子受体结合、泛素样蛋白连接酶结合、氧化还原酶活性等生物过程。通过KEGG通路富集分析，发现茵陈蒿汤中多种成可以通过Hepatitis B、流体剪应力与动脉粥样硬化、MAPK、PI3K-Akt、肿瘤坏死因子、IL-17、肝细胞癌、低氧诱导因子1（HIF-1）等信号通路作用于OJ。MAPK是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导细胞生长、分裂、分化、死亡以及细胞间的功能同步等多种生理过程。其中c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路是MAPK中重要的通路之一，Wang等[17]发现大黄酸诱导的活性氧簇（ROS）激活了JNK/Jun/caspase-3信号通路，进而诱导肝癌细胞凋亡。PI3K/Akt信号通路是细胞内抑制细胞凋亡的关键性信号转导通路。研究证明，PI3K/Akt通路激活可以抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡，对肝损伤具有保护作用[18]。HIF-1是低氧浓度或缺氧应答中关键的转录因子，通过激活下游靶基因，参与细胞的增殖、凋亡、血管生成、能量代谢等环节。研究发现蕨麻多酚可能在血管内皮细胞缺氧时通过下调HIF-1α，进而抑制内皮素（ET）-1的合成和分泌；上调eNOS，下调iNOS，调控一氧化氮（NO）的合成和分泌;调节NO和ET-1的动态平衡，发挥抗缺氧保护作用[19]。上述研究，体现了茵陈蒿汤多成分、多靶点的特点，其可能通过促进胆汁分泌排泄、抗炎、抑制肝纤维化、抗氧化、减轻肝细胞损伤和凋亡等多个生物过程及作用通路，起到治疗OJ的作用。

通过对KEGG富集结果分析发现，靶点蛋白NOS3（eNOS）和NOS2（iNOS）参与流体剪应力与动脉粥样硬化、PI3K-Akt、HIF-1等多条通路，并与茵陈蒿汤中多个化合物有关，因此将eNOS和iNOS作为目的蛋白进行分子对接和免疫组化实验验证。两者均是合成NO的关键酶，NO在OJ肝损害中具有双重作用。在疾病发展早期，机体NO水平相对较低，可扩张血管，抑制血小板聚集，改善肝脏血流；NO还具有抗氧化作用，可以与超氧阴离子等自由基结合，产生低毒性自由基，减轻肝损伤。随着疾病的发展，内毒素等各种刺激因子引起iNOS表达增加，生成大量的NO，过量的NO具有细胞毒性，加重肝损伤[20]。上述结果表明茵陈蒿汤中与交集靶点有关的化学成分主要有槲皮素、山奈酚、异鼠李素等，因此将eNOS和iNOS蛋白分别与这些化学成分进行分子对接，发现对接的最低结合能均≤-5.0 kcal/mol，且通过分子对接模式图可知这些化学成分可能与蛋白上多个氨基酸残基相结合，表示eNOS、iNOS和茵陈蒿汤中的主要化合物槲皮素、山奈酚、异鼠李素有较好的结合能力。通过对大鼠肝组织免疫组织化学研究发现，与假手术组相比，模型组肝组织中iNOS蛋白表达升高，而eNOS蛋白表达降低；与模型组相比，茵陈蒿汤组肝组织中iNOS蛋白表达降低，eNOS蛋白表达升高。这可能是OJ发生时，机体炎症和内毒素等刺激因子引起肝组织中iNOS水平迅速增加，产生大量NO，造成肝损伤；而茵陈蒿汤通过调节eNOS和iNOS，从而降低NO的过量表达，维持一定生理量，使其产生抗氧化、改善肝脏微循环的作用。

本研究通过网络药理学方法研究茵陈蒿汤治疗OJ的有效成分、作用靶点及通路，体现了茵陈蒿汤多成分、多靶点、多途径的作用特点，系统性分析了茵陈蒿汤治疗OJ的可能作用机制，并通过分子对接技术证实茵陈蒿汤中的多种活性成分可作用于eNOS、iNOS蛋白。免疫组化实验证实茵陈蒿汤对OJ氧化应激的调节可能与改变eNOS、iNOS蛋白的表达有关，这为进一步研究茵陈蒿汤提供了思路和理论依据。