心脏瓣膜疾病手术前后血流动力学异常与vWF和ADAMTS13的关系

杨悦，宋昱，贾克刚

（1.天津医科大学心血管病临床学院，天津300457；2.天津市滨海新区塘沽大华医院，天津300450；3.泰达国际心血管病医院CCU，天津300457；4.泰达国际心血管病医院检验科，天津300457）

血流剪切应力是指在流动过程中各层流间产生的类似摩擦力的机械应力。血流动力学异常心脏瓣膜病（cardiac valvular disease with abnormal hemodynamic，CVDAH）是指由于血液流动的腔道发生了几何形状的改变（如弯曲、狭窄、反流等），导致剪切应力变化的一类心脏疾病，包括主动脉瓣狭窄、二尖瓣狭窄、主动脉瓣反流等心脏瓣膜病。在血液循环低剪切条件下，血管性血友病因子（vWF）以球形静止的多聚体状态存在，并隐藏血小板受体和内皮下细胞外基质（ECM）结合位点，此时，高分子量vWF多聚体含量下降，vWF活性下降，血小板的黏附聚集能力下降，但在高剪切应力（高于2 000 S-1）条件下，vWF经高度动态调节，由球形vWF分子形式迅速展开和伸长成长链结构，暴露出血小板和ECM的结合位点，并转换功能状态为高活性形式[1]。血管性血友病因子裂解蛋白酶（ADAMTS13）是一种vWF裂解酶，切割超大分子或大分子vWF多聚体为小分子vWF多聚体。高剪切力下，vWF长链的伸长率决定了ADAMTS13结合位点的暴露，从而起到负反馈调节作用。在某种程度上，ADAMTS13可反映超大分子或大分子vWF多聚体的形成。本文以血流动力学异常瓣膜疾病手术前后剪切应力的变化为研究背景，以vWF抗原（vWF：Ag）、vWF活性（vWF：AC）、ADAMTS13抗原（ADAMTS13：Ag）、ADAMTS13活性（ADAMTS13：AC）为研究靶点，探讨手术前后剪切应力变化对vWF、ADAMTS13的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年7月—2019年4月于天津泰达国际心血管病医院住院的CVDAH患者40例，其中主动脉瓣狭窄患者19例，二尖瓣狭窄患者18例，主动脉瓣反流患者3例。均成功进行瓣膜置换手术。男性26例，女性14例，年龄52.0（46.0，55.8）岁。主动脉瓣狭窄、二尖瓣狭窄、主动脉瓣反流患者诊断标准符合美国心脏协会和美国心脏病学会（AHA/ACC）发布的《2014年心脏瓣膜病患者管理指南》。入选患者均满足血流动力学异常的标准：（1）主动脉瓣狭窄：峰值流速>3 m/s。（2）二尖瓣狭窄：峰值流速>1.9 m/s。（3）主动脉瓣、三尖瓣反流：峰值流速>3 m/s。选取同期健康人作为对照组（32名），男性14名，女性18名，年龄46.0（42.0，52.5）岁。排除标准：（1）恶性肿瘤。（2）严重的肝脏、肾脏疾病。（3）凝血障碍。（4）严重的免疫系统疾病。（5）糖尿病。（6）心脏疾病和脑血管疾病。本研究定义：吸烟者是指吸烟≥1支/d，且连续半年以上；饮酒者是指饮酒≥50 mL/周，且连续半年以上[2]。在研究开始前，40例患者均已被告知其临床病历及相关检查将用于本次研究，均同意加入本研究。

1.2 手术方法及患者用药 全部病例均在全麻（静息符合麻醉）、低温（28～32℃）、肝素化体外循环下行瓣膜置换手术，使用机械瓣或生物瓣进行瓣膜置换。本研究患者术前用药情况：20例患者应用依诺肝素钠注射液，30例患者应用降压类药物，7例患者应用降脂类药物，28例患者应用利尿药。

1.3 检测指标采集 收集所有患者基线指标、实验室检查指标。所有患者于术前、术后1 h、术后1 d、术后5～7 d，对照组于空腹状态下采集静脉血，枸橼酸钠真空抗凝管采集2.7 mL、EDTA-K2真空抗凝管采集2 mL、分离胶促凝管采集3.5 mL，混匀。分离胶促凝血及枸橼酸钠抗凝血3 500 r/min离心10 min后分离出血清或血浆，于-80℃保存，择期进行vWF：Ag、vWF：AC、ADAMTS13：Ag、ADAMTS13：AC的检测。

1.4 仪器与试剂 Sysmex CS-5100凝血分析仪、Sysmex XE-5000全自动血细胞分析仪（日本Sysmex公司），7600型全自动生化分析仪（日本日立公司），ACL-TOP700凝血仪（美国沃芬公司）；血小板数（PLT）、血小板压积（PCT）、血小板分布宽度（PDW）、大血小板比率（PLCR）、平均血小板体积（MPV）、血红蛋白（HGB）试剂（日本Sysmex公司），纤维蛋白原（FBG）试剂（德国Siemens公司），总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）、肌酐、尿素、尿酸（UA）（德国Siemens公司），vWF：Ag、vWF：AC测定（免疫比浊法）试剂（美国沃芬公司），ADAMTS13：Ag ELISA法测定试剂（武汉瑞美生物公司），ADAMTS13：AC测定（荧光共振能量转换法）试剂（日本Peptids公司）。

1.5 检测方法 vWF：Ag、vWF：AC测定：在ACLTOP700凝血仪上用免疫比浊法进行测定，按仪器和试剂盒说明书进行操作。ADAMTS13：Ag测定：双抗体夹心ELISA法检测血浆ADAMTS13：Ag水平，按试剂盒说明进行操作。ADAMTS13：AC测定：按照叶絮和吴朝霞等[3]的方法稍加改进，采用荧光共振能量转移法测定血浆ADAMTS13：AC，按试剂盒说明书操作。以标准血浆：Buffer=1∶20为100%活性[4]，以此为依据计算其他标准血浆的百分活性。

1.6 统计学处理 用SPSS 19.0及GraphPad Prism 7.0统计软件进行。连续变量经正态性检验，正态分布以±s表示，多组间比较（3组及以上）应用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；非正态分布以M（P25，P75）表示，多组间比较（3组及以上）应用Kruskal-WallisH检验，组间两两比较采用Nemenyi检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术前两组临床基线资料比较 两组间年龄、性别、吸烟史、饮酒史、收缩压、舒张压、HB、MPV、PDW、PLCR、FBG、TG、LDL-C差异均无统计学意义（均P>0.05）；与对照组相比，手术组的BMI、尿素、肌酐、UA值均降低，PCT、PLT、TC、HDL-C值均升高，差异均有统计学意义（均P<0.05，P<0.01），见表1。

2.2 手术组术前与术后5~7 d峰值流速（V）、最大跨瓣压差（△P）结果比较 术后5~7 d V为（2.16±0.69）m/s，低于术前（2.59±1.17）m/s，差异有统计学意义（t=2.014，P=0.048）；术后5~7 d△P为16.00（9.00，27.00）mmHg，低于术前水平20.00（9.75，39.75）mmHg，差异有统计学意义（Z=-2.078，P=0.041）。

2.3 两组术前、术后vWF和ADAMTS13比较 手术组vWF：Ag及vWF：AC在术后呈上升趋势，在术后1 d时达到峰值，术后5~7 d开始下降，但均显著高于术前水平。ADAMTS13：Ag在术后呈下降趋势，术后1 d下降达谷值，ADAMTS13：AC在术后1 h达到最低值，但术后1 h与术后1 d ADAMTS13：Ag、ADAMTS13：AC差异均无统计学意义，术后5~7 d时ADAMTS13：Ag及ADAMTS13：AC呈上升趋势（表2、3）。

表2 手术组手术前后及对照组vWF:Ag及vWF:AC结果比较[M（P25，P75）]Tab 2 Comparison of vWF:Ag and vWF:ACresultsin theoperation group beforeand after theoperation and thecontrol group[M（P25，P75）]

表3 手术组手术前后及与对照组ADAMTS13:Ag及ADAMTS13:AC结果比较[M（P25，P75）]Tab 3 Comparison of ADAMTS13:Ag and ADAMTS13:AC results in the operation group before and after the operation and the control group[M（P25，P75）]

3 讨论

研究表明，血流动力学因素如血流量、流动/壁面剪切力、血流冲击方向、旋动流态发生改变对动脉扩张[5]、动脉瘤[6]的形成发挥关键作用，过高或过低的壁面剪切应力除可促进动脉瘤的形成与发展，也对血液流动产生扰动，形成局部极高剪切应力、极低剪切应力等不稳定的血流动力学环境。主动脉瓣狭窄、二尖瓣狭窄、主动脉瓣反流等血流通道的改变导致V、△P等血流动力学指标异常，高剪切应力形成对血管内皮造成损害，影响vWF和ADAMTS13的功能。vWF是一种由血管内皮细胞和巨核细胞产生的一种大分子黏附糖蛋白[7]，以超大型vWF多聚体（UL-vWF）形式存在于特异的细胞器内[8]；ADAMTS13主要来源于肝星状细胞和血管内皮细胞[9]。在低剪切应力条件下，vWF自我结合为致密的大分子多聚体，从而失去促进血小板黏附的功能[10]。在生理性剪切应力条件下（2 000 s-1<切应力<10 000 s-1），大分子vWF多聚体部分解聚，暴露出胶原以及ADAMTS13的结合位点，使ADAMTS13与之结合并进行剪切，从而发挥调节vWF多聚体分布的作用，使止血与血栓形成达到平衡[11]。在病理性剪切应力条件下（切应力>10 000 s-1），大分子vWF多聚体构象改变过度解聚，暴露出过多的ADAMTS13结合位点，ADAMTS13与之结合并过度剪切，导致大分子多聚体数量明显减少[12]。

有学者对13例经皮二尖瓣边缘修复手术患者研究表明，与基线相比，成功接受经皮二尖瓣边缘修复术的患者平均vWF：Ag和vWF：AC显著升高（P=0.006、0.028）[13]。本研究显示，CVDAH患者术后1 h、术后1 d、术后5~7 d vWF：Ag、vWF：AC均明显高于术前和对照组（P<0.05或P<0.001）。CVDAH患者术后1 h、术后1 d ADAMTS13：Ag、ADAMTS13：AC均明显低于患者术前水平，与文献报道一致。表明随手术后剪切应力变化，CVDAH患者vWF：Ag和vWF：AC在术后呈上升趋势，在术后1 d达峰值，vWF：AC呈高活性状态，大分子vWF多聚体增多，术后5~7 d呈下降趋势，大分子vWF多聚体部分被切割，但水平仍高于术前和对照组。ADAMTS13在术后1 h及术后1 d均呈下降趋势（ADAMTS13：Ag和ADAMTS13：AC术后1 h与术后1 d比较无统计学意义），在术后5～7 d ADAMTS13：Ag和ADAMTS13：AC呈上升趋势，与vWF：Ag、vWF的变化趋势相反。

主动脉瓣狭窄患者大分子vWF多聚体减少是由于高剪切应力下大分子vWF多聚体构象改变，更易被ADAMTS13剪切水解，进而被肾脏清除[14]。van Belle等[15]对行经导管主动脉瓣置换术（TAVR）的患者进行术中监测大分子vWF多聚体的水平，发现大分子vWF多聚体缺陷可在动脉瓣置入后数分钟内得到纠正。笔者在研究中观察到CVDAH患者术前vWF：Ag、vWF：AC、ADAMTS13：Ag、ADAMTS13：AC和对照组比较无统计学意义，与文献报道不一致，可能与患者术前服用了改善和治疗心脏功能的药物有关，其中包括降脂药、降压药、抗凝药等，各种药物通过不同机制起到抑制血管内皮损伤，稳定血管内皮功能的作用[16-17]。

本文研究显示，与剪切应力有关的V及△P水平在术后5～7 d均明显低于术前，表明瓣膜置换手术成功对于改善和修复血流动力学异常起到了明显作用。术后5～7 d vWF：Ag、vWF：AC开始呈下降趋势，ADAMTS13：Ag、ADAMTS13：AC开始呈上升趋势。推测ADAMTS13的切割重新调节了大分子vWF多聚体的分布，向止血与血栓形成平衡的方向发展。

本研究尚存在一定的局限性：（1）病例样本量较少，无法进行预后随访，尚需扩大样本量进一步研究。（2）对照组来自同期健康志愿者，未对其V、△P等资料进行统计，不能与手术组进行比较。（3）由于条件所限，术后时间点的基线资料未进行统计，影响了进一步的分析。

综上，本研究认为围手术期vWF、ADAMTS13对血管内皮损伤有诊断价值。即CVDAH患者术后vWF的下降趋势、ADAMTS13的上升趋势能够反映血流剪切应力降低，血管内皮损伤减轻。