乙肝肝纤维化患者血液miR⁃122、miR⁃181a水平与病情严重程度的关系

崔红梅 卢坤玲 付丽坤 张利利

在我国，乙肝病毒感染是肝病的主要病因，流行病学报道，在全世界范围内，30%的肝硬化及45%的肝癌患者是由慢性乙型肝炎（Chronic hepa⁃titis B，CHB）发展而来［1］。目前认为，肝纤维化的诊断、分期对评估慢性肝病程度及乙肝抗病毒治疗具有重要指导意义，对于延缓肝硬化、肝癌的进展均有积极作用［2］。当前肝脏病理学检查仍是肝纤维化诊断的金标准，但肝脏病理学诊断为创伤性检查，有较大的并发症发生风险［3］。microRNA 是一种广泛存在的非编码小RNA，对蛋白表达具有调节作用，参与细胞生长、分化、代谢等多种生理学功能。miR⁃122 位于18q21.31 位点，是肝脏组织中表达量最丰富的的RNA，研究表明其在肝细胞生长、脂质代谢、病毒感染等多种生物学过程中均发挥调控作用［4］。miR⁃181a 是miR⁃181 家族成员，位于9号染色体正链上，研究表明miR⁃181 可直接靶向肝分化转录调节因子，调节肝细胞的生长及增殖［5］。本研究初步探讨miR⁃122、miR⁃181a 对肝纤维化程度评估的价值，以期为肝纤维化病情的评估及治疗提供一定参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年3月至2020年5月本院收治的186 例CHB 患者作为CHB 组。纳入标准：①符合《慢性乙型肝炎防治指南》［6］，乙型肝炎表面抗原阳性6 个月及以上；②行肝脏组织病理检查；③对本研究知情并签署知情同意书。排除标准：①其他类型病毒性肝炎者、酒精性肝炎者；②接受抗病毒或抗纤维化治疗者；③存在药物性肝损伤者；④合并恶性肿瘤者。CHB 组患者中男性120 例，女性66 例，平均（44.88±8.52）岁。另选取本院100 例同期健康体检者作为对照组。对照组受试者中男性66 例，女性34 例，平均（45.27±8.96）岁，两组性别组成及年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准通过。

1.2 方法

血清生化检测：对照组于体检当日、CHB 患者于行肝组织病理学检查当日采集5 mL 空腹静脉血，抗凝后提取血清，采用全自动生化分析仪检测天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）等肝生化指标。

肝脏组织病理学检查：CHB 组患者行超声引导下肝脏穿刺及组织病理学检查，标本长度>1.0 cm，至少包括6 个汇管区，参考国际Scheuer 系统规定的标准［7］进行肝纤维化分期，其中S0（25 例）、S1（44 例）、S2（35 例）、S3（52 例）、S4（30 例）。

miR⁃122、miR⁃181a 表达水平：采集患者外周空腹静脉血，抗凝处理，采用血液RNA 提取试剂盒提取标本中总RNA，采用反转录试剂盒将总RNA 转换成cDNA，采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测miR⁃122、miR⁃181a 表达，内参为U6，引物序列如下：miR⁃122（正向引物：5′⁃TGC⁃GCTGGAGTGTGACAATGGT⁃3′，反向引物：通用引物）；miR⁃181a（正向引物：5′⁃AACATTCAAC⁃GCTGTCGGTGAGT⁃ 3′，反向引物：通用引物）；U6（正向引物：5′⁃GCTTCGGCAGCACATATACTA⁃AAAT⁃3′，反向引物：5′⁃CGCTTCACGAATTTGC⁃GTGTCAT⁃3′）。采用相对定量法计算表达水平，ΔCt=目的扩增Ct 值⁃U6 Ct 值，以2⁃ΔΔCt表示为目的产物的表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据处理与统计分析，计数资料以n（%）表示，行χ2检验；计量资料以（±s）表示，组间比较行独立样本t检验、多组间比较采用F 检验；采用Pearson及Spearman相关性分析指标间的相关性；绘制受试者特征工作曲线（ROC）分析指标诊断价值，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者临床资料及miR⁃122、miR⁃181a表达水平比较

CHB 组ALT、AST、TBIL 等生化指标及miR⁃122、miR⁃181a 表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 两组受试者临床资料及miR⁃122、miR⁃181a 表达水平比较（±s）Table 1 Comparison on clinical data and expression levels of miR⁃122 and miR⁃181a between 2 groups（±s）

表1 两组受试者临床资料及miR⁃122、miR⁃181a 表达水平比较（±s）Table 1 Comparison on clinical data and expression levels of miR⁃122 and miR⁃181a between 2 groups（±s）

组别CHB 组对照组t 值P 值n 186 100 ALT（U/L）75.48±10.71 22.41±5.28 46.575<0.001 AST（U/L）55.98±15.71 24.15±5.99 19.500<0.001 TBIL（μmol/L）19.38±4.71 10.22±3.96 16.552<0.001 miR⁃122 3.37±0.62 1.24±0.33 31.988<0.001 miR⁃181a 1.53±0.32 0.45±0.20 30.669<0.001

2.2 不同肝纤维化分期患者临床资料及miR⁃122、miR⁃181a 表达水平比较

随着肝纤维化分期的升高，CHB 患者ALT、AST、TBIL 等肝生化指标及miR⁃181a 表达升高，miR⁃122 表达水平降低（P<0.05）。见表2。

表2 不同肝纤维化分期患者临床资料及miR⁃122、miR⁃181a 表达水平比较（±s）Table 2 Comparison on clinical data and expression levels of miR⁃122 and miR⁃181a among patients with different stages of liver fibrosis（±s）

表2 不同肝纤维化分期患者临床资料及miR⁃122、miR⁃181a 表达水平比较（±s）Table 2 Comparison on clinical data and expression levels of miR⁃122 and miR⁃181a among patients with different stages of liver fibrosis（±s）

注：与S0 期比较，aP<0.05；与S1 期比较，bP<0.05；与S2 期比较，cP<0.05；与S3 期比较，dP<0.05。

组别S0 S1 S2 S3 S4 F 值P 值n 25 44 35 52 30 ALT（U/L）48.52±8.45 55.17±10.22a 79.52±12.74ab 92.14±13.18abc 94.17±22.17ab 98.111<0.001 AST（U/L）25.16±4.71 33.96±6.82a 75.14±10.27ab 68.12±12.71abc 70.59±13.52ab 165.727<0.001 TBIL（μmol/L）13.52±3.26 13.88±4.71 21.71±5.11ab 20.96±5.26ab 26.85±6.12abd 41.205<0.001 miR⁃122 4.52±0.86 4.01±0.85 3.22±0.74ab 2.85±0.39abc 2.56±0.45ab 47.790<0.001 miR⁃181a 0.85±0.12 1.02±0.20a 1.66±0.43ab 1.98±0.40abc 1.90±0.42ab 79.990<0.001

2.3 miR⁃122、miR⁃181a 表达水平与临床资料、肝纤维化分期的相关性

Pearson相关性分析示，miR⁃122 与CHB 患者ALT、AST、TBIL、肝纤维化程度等呈负相关（P<0.05），miR⁃181a 与肝生化指标呈正相关（r1=0.501，r2=0.444，r3=0.370，r4=0.396，P均<0.05）。Spearman相关性分析示，miR⁃122与肝纤维化程度呈负相关（P<0.05），miR⁃181a与肝纤维化程度呈正相关（P<0.05）。

2.4 miR⁃122、miR⁃181a 表达水平对肝纤维化程度的评估价值分析

ROC 曲线示，miR⁃122、miR⁃181a 表达水平诊断严重肝纤维化（S3～S4）的曲线下面积分别为0.851、0.783，当截点值为3.26、1.42 时，约登指数最大（0.566、0.516）。见表3、图1。

表3 miR⁃122、miR⁃181a 表达水平诊断严重肝纤维化（S3～S4）的价值分析Table 3 Value of miR⁃122 and miR⁃181a in the diagnosis of severe liver fibrosis（S3⁃S4）

图1 miR⁃122、miR⁃181a 表达水平诊断严重肝纤维化（S3～S4）的价值分析Figure 1 Value of miR⁃122 and miR⁃181a in the diagnosis of severe liver fibrosis（S3⁃S4）

3 讨论

miR⁃122 在肝脏组织中高度表达，约占全部miRNA 的70%。miR⁃122 主要由肝脏细胞释放，研究表明，肝细胞过表达miR⁃122 可抑制HBV DNA 的复制，降低病毒对肝细胞的损伤［8］。miR⁃122可抑制肝星状细胞增殖，减少肝脏胶原的产生从而抑制纤维化的产生［9］。本研究结果显示，与健康对照组比较，CHB 组miR⁃122 的表达明显升高，这一结果与Liu 等人［10］研究结果类似。miR⁃181a 是一种广泛存在于细胞中的miRNA，研究表明其在细胞分化、生长及程序性死亡方面发挥重要作用［11］。目前miR⁃181a 与肝纤维化之间的关系尚未完全阐释清楚，推测可能与其介导肝脏炎症从而影响肝纤维化进程有关。既往有研究表明miR⁃181a 与巨噬细胞活化后白细胞介素⁃1β、肿瘤坏死因子⁃α、转化生长因子⁃β1 等炎症因子水平呈相关关系［12］；而肝纤维化过程本质上是胞外基质合成及降解失衡的过程，miR⁃181a 可激活炎症因子亢进导致肝脏炎症损伤，同时也可调节肝星状细胞活性，促进基质胶原降解合成的失衡，促进肝纤维化进程。

本研究结果显示，不同肝纤维化水平CHB 患者中，随着肝纤维化程度的升高，miR⁃122 的表达降低，且其水平与肝纤维化程度呈负相关。分析其原因可能为miR⁃122 主要由肝脏细胞释放，肝脏纤维化程度越高，肝细胞损伤范围越大，肝细胞合成miR⁃122 能力降低，其抑制肝纤维化的作用减弱，肝纤维化进展更快，两者形成恶性循环。既往国外开展的一项研究表明，与CHB 患者相比，肝硬化患者miR⁃122 表达量明显降低，其表达水平与肝功能指标呈负相关［13］。国内开展的一项研究表明，随着肝纤维化程度的升高，miR⁃122 表达量降低，其与HBV⁃DNA 载量、ALT、AST 等肝功能指标呈正相关，而与肝纤维化程度呈负相关［14］。本研究与上述研究结果类似。本研究中CHB 患者miR⁃181a 表达升高，且随着肝纤维化程度的升高，其表达呈现升高趋势，推测miR⁃181a 可能与HBV 感染后炎症因子产生的肝脏损伤及肝纤维化进程有关，其高表达或可促使炎症亢进、肝脏损伤及肝纤维化进程。既往陈婧等人［15］开展的一项研究证实CHB 患者miR⁃181a 表达升高，且随着肝硬化分期的加重，整体呈现升高趋势。但徐艺丹等人［16］开展的一项动物研究证实，肝脏纤维化小鼠miR⁃181 表达降低，且随着分期程度升高呈下降趋势。本研究与前者研究结果类似，两者研究存在差异的原因可能为研究对象差异所致。

目前肝硬化前期的肝纤维化评估是逆转肝脏病变的关键，组织病理学检查是金标准，但鉴于其风险，其临床应用有较大的限制。本研究结果显示提示两者对肝硬化严重程度有一定参考价值。

综上，慢性乙肝肝纤维化患者伴有miR⁃122、miR⁃181a 水平的变化，且与肝纤维化程度相关，临床可将其作为评估纤维化程度的参考指标。本研究局限性在于样本量较少，未来仍有待进一步扩大样本进行研究。