HPLC法同时检测金樱子果实中两种三萜化合物的含量

高品一, 司星星， 张文超， 刘学贵, 李丹琦

(1.沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142；2.沈阳化工大学 功能分子研究所, 辽宁 沈阳 110142；)3.沈阳化工大学 硼镁资源开发与精细化工国家地方联合工程实验室， 辽宁 沈阳 110142；4.沈阳化工大学 辽宁省绿色功能分子设计与开发重点实验室， 辽宁 沈阳 110142)

金樱子(RosalaevigataMichx.)为蔷薇科蔷薇属植物，又名刺头、糖莺子、糖橘子、棠球、灯笼果、藤勾子等，广泛分布于安徽，两湖等地[1-3].金樱子果实成熟干燥后可入药，是中国广泛使用的传统民间药草，具有改善肾脏健康、固精缩尿、涩肠止带、抑制动脉硬化和减少炎症等作用[4-6].金樱子果实中含有多种活性成分，包括三萜类、黄酮类、多糖类、鞣质类、酚酸类、甾体类等化合物，主要活性成分是三萜皂苷类，具有抗氧化、抗真菌和降糖降脂等作用[7].金樱子的果实还可以用作健康食品和食品添加剂，如滋养口服液、果酒、醋和果酱等[8-10].目前关于金樱子活性成分测定的研究报道多集中于总黄酮[11]、多糖[12]、总皂苷[13]、儿茶素[14]等.彭焱辉等用分光光度法测定了金樱子果实中总皂苷的含量[13].本文对金樱子果实中两种三萜化合物皂苷及皂苷元的富集方法进行了研究.建立了HPLC法测定金樱子果实中两种三萜化合物含量的具体方法，为完善其质量标准和有效控制其质量提供依据.

1 实验部分

1.1 仪器与材料

LC3000型高效液相色谱仪，北京创新通恒科技有限公司；promosil C18高效液相色谱柱，天津博纳艾杰尔科技有限公司；R-3旋转蒸发仪，瑞士步琪有限公司；电子天平BS-224S，赛多利斯科学仪器北京有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器责任公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司.

柱层层析硅胶(100～200、200～300、300～400目)，青岛海洋化工分厂；HSGF 254硅胶薄层层析硅胶板(20 cm×10 cm)，青岛海洋化工分厂；反向高效液相色谱柱，YMC-ODS-A-HG，北京慧得易科技有限责任公司；二氯甲烷，天津市大茂化学试剂厂；乙酸乙酯，石油醚，无水乙醇，天津市大茂化学试剂厂；其他试剂均为分析纯，市售.

金樱子药材购买于沈阳市药材市场，由沈阳药科大学路金才教授鉴定为金樱子RoseLaevigataMichx.的干燥果实；19α-羟基亚细亚酸(皂苷元)和19α-羟基亚细亚-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(皂苷)标准品，沈阳化工大学化工与制药研究室制备(样本现保存在沈阳化工大学化工与制药研究室).

1.2 有效成分的提取

分别称取相同质量的金樱子干燥果实粉末在相同条件下分别以微波法和超声波法提取有效成分，处理后注入高效液相色谱仪进行分析.将金樱子果实一部分去籽处理按超声提取条件提取，另一部分不去籽提取，将提取液处理后注入高效液相色谱仪按实验方法测定比较两种化合物含量.

1.3 HPLC测定条件

色谱柱：promosil C18(4.6 × 250 mm，5 μm)；检测波长210 nm，柱温15 ℃；流动相V(甲醇)∶V(水)=48∶52，流速0.9 mL/min.进样量：25 μL，面积法计算含量.

1.4 样品溶液的制备

标准样品溶液制备流程：皂苷(19α-羟基亚细亚-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和皂苷元(19 α-羟基亚细亚酸)→减压干燥→分别精密称取5 mg，2.8 mg→无水甲醇溶解→10 mL容量瓶定容.

样品溶液制备流程：(1)去籽金樱子果实→干燥粉碎过40目筛→精密称取5 g→V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=5∶1定容于50 mL容量瓶→超声处理30 min→减压干燥→甲醇溶解定容于50 mL容量瓶→超声处理30 min→甲醇定容;(2)未去籽金樱子果实→干燥粉碎过40目筛→精密称取5 g→V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=5∶1定容于50 mL容量瓶→超声处理30 min→减压干燥→甲醇溶解定容于50 mL容量瓶→超声处理30 min→甲醇定容.金樱子果实样品中有效成分的超声提取条件为：超声时间30 min、温度35 ℃、超声功率70 W.

2 结果与讨论

2.1 金樱子皂苷元的提取

采用冷凝回流提取工艺，以体积分数为85 %的乙醇水作为溶剂进行提取.14.5 kg干燥粉碎的金樱子果实回流提取3次，流动相为石油醚，每次60 min；然后将金樱子果实晾干，并将其用体积分数为85 %的乙醇水作为溶剂进行冷凝回流提取3次，每次2.5 h，并将粗提取液进行集中存放；使用旋转蒸发仪进行减压浓缩，浓缩至一定浓度使用电磁炉继续挥发掉多余的乙醇，得金樱子浓缩液，将浓缩液继续挥发干溶剂变成浸膏；使用分液漏斗和铁架台对浸膏进行萃取；将适量的浸膏用蒸馏水溶解后转移到分液漏斗中，加入等体积的有机溶剂二氯甲烷，进行反复萃取(约3次)；萃取完成后得到有机层二氯甲烷和水层，在水层中加入等体积的乙酸乙酯，进行反复卒取3次；萃取完后得到乙酸乙酯层和水层，萃取后将二氯甲烷层、乙酸乙酯层和水层分别合并.

2.2 金樱子皂苷元的纯化富集

取萃取后的二氯甲烷层样品与100～200目硅胶(拌样质量比为1∶3)在研钵中充分拌样；准备硅胶柱固体相，上样，洗脱(流动相二氯甲烷和无水甲醇体积比分别为30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1，每组流动相冲洗5次);通过TLC检测进行相同组分的合瓶.

将富集的减压开放硅胶样品以拌样质量比为1∶3在研钵中充分拌样；上样，将拌好的样品置于硅胶柱固体相上均匀平整分布，样高约1.5 cm，然后将200～300目的硅胶装入1 cm左右的玻璃柱中，放入适量棉花；以二氯甲烷和无水甲醇体积比为12∶1为流动相进行洗脱，洗脱到最后一瓶用TLC检测无样品为止；通过TLC检测进行相同组分的合瓶.将富集到的样品用适量无水甲醇进行溶解，然后上样在ODS柱上，将其挂样一夜，用体积分数50 %，55 %，60 %和70 %的甲醇水为流动相对其进行洗脱，每个梯度洗脱5次；通过TLC检测进行相同组分的合瓶.经过ODS纯化后得到金樱子皂苷元纯品1.5 g，HPLC(液相条件见1.3) 纯度均大于95 %.

2.3 金樱子皂苷元鉴定

将实验得到的白色无定形粉末进行质谱和核磁谱分析.ESI- MS(m/z):527[M+Na]+.1H-NMR(600 MHz,C5D5N)，δ:5.55(1H,br s,H-12),4.23(1H,dt,J=9.6,4.2 Hz,H-2),4.17(1H,d,J=10.8 Hz,H2-23),4.15(1H,d,J=10.8 Hz,H2-23),3.69(1H,d,J=9.6 Hz,H-3)，3.06(1H,dt,J=8.4,2.4 Hz,H-16),3.01(1H,s,H-18),1.62(3H,s),1.48(3H,s),1.10(3H),1.09(3H,d,J=6.4 Hz),1.07(3H,s),1.04(3H,s).13C-NMR(150 MHz,C5D5N),δ:47.8(C-1),68.8(C-2),78.3(C-3),42.1(C-4),47.9(C-5),18.6(C-6),33.1(C-7),40.4(C-8),47.8(C-9),38.3(C-10),24.1(C-11),127.9(C-12),139.9(C-13),42.1(C-14),29.2(C-15),26.3(C-16),48.3(C-17),54.5(C-18),72.6(C-19),42.3(C-20),26.9(C-21),38.3(C-22),66.5(C-23),14.3(C-24),16.7(C-25),17.2(C-26),24.6(C-27),180.6(C-28),27.0(C-29),17.3(C-30).以上数据与文献[15]基本一致，表明化合物是金樱子皂苷元.

2.4 线性关系考察

精密吸取过滤后的标准样品溶液5、10、15、20、25、30、40 μL，按给定色谱条件测定，以测得的峰面积为纵坐标，标准样品进样量为横坐标进行线性回归分析，结果如图1所示.由图1可以看出：皂苷标准曲线方程为y=5868.69x+6.655 8，R=0.997 0；皂苷元标准曲线方程为y=9945.21x-0.902 56，R=0.996 9.实验结果表明皂苷和皂苷元含量在0.002～0.03 mg范围内线性关系很好，适合作含量测定的标准曲线.

图1 皂苷和皂苷元的标准曲线

2.5 精密度实验

精密吸取经微孔滤膜过滤的标准样品溶液10 μL，重复进样5次，在1.3给定色谱条件下进行测定，记录峰面积，测得皂苷和皂苷元的峰面积分别为39.169 3，29.118 7；39.457 9，29.688 1；39.604 7，29.552 9；39.682 5，29.616 8；39.145 4，29.109 4.皂苷峰面积的RSD为0.62 %，皂苷元峰面积的RSD为0.95 %，说明仪器系统及进样方法精密度很好.

2.6 重现性实验

精密称取同一金樱子干燥粉末3份，按样品溶液制备流程制备样品溶液，每份精密吸取25 μL，经微孔滤膜过滤的样品溶液按照1.3给定的色谱条件进行测定，记录峰面积.经计算总样中皂苷和皂苷元峰面积的RSD分别为2.5 %和1.4 %，该结果说明此方法的重现性良好.

2.7 稳定性实验

精密吸取同一份经微孔滤膜过滤的金樱子样品溶液25 μL，分别于0、3、6、9和12 h注入高效液相色谱仪进样，按照1.3给定的色谱条件进行测定，记录峰面积.比较所得到的5组峰面积，结果表明在12 h内进样时，总样中的皂苷及皂苷元等其他组分的检测峰型稳定性很好.

2.8 加样回收率的计算

取3份已测定2种化合物含量的去籽金樱子干燥果实粉末各5 g，分别精密称量3.2 mg、3.19 mg、3.2 mg皂苷和3.4 mg、3.39 mg、3.38 mg皂苷元标准样品平行加入3份金樱子中，按照上述标准样品制备方法制备待测溶液，经微孔滤膜过滤后按1.3给定的色谱条件注入高效液相色谱仪中测定其峰面积，依据峰面积计算每份皂苷和皂苷元的含量，计算加样回收率，结果如表1所示.

表1 金樱子中皂苷和皂苷元的加样回收率

由表1可以看出：皂苷和皂苷元的加样回收率分别为101.56 %和102.94 %，此结果说明HPLC方法的重现性及准确度很好.

2.9 样品含量测定

分别精密称取3份去籽金樱子干燥果实粉末、3份未去籽金樱子干燥果实粉末各5 g.按样品溶液制备方法制备样品溶液，按1.3给定色谱条件测定峰面积，计算皂苷和皂苷元的含量结果见表2和表3.表2、表3结果表明：去籽金樱子干燥果实中的皂苷和皂苷元含量高于未去籽金樱子干燥果实，去籽后的平均含量皂苷为10.37 mg/g、皂苷元为5.36 mg/g，而未去籽金樱子干燥果实的平均含量皂苷为8.39 mg/g、皂苷元为4.60 mg/g，建议提取两类成分时将籽去掉以提高得率.

表2 去籽金樱子果实中皂苷和皂苷元含量

表3 未去籽金樱子果实中皂苷和皂苷元含量

3 结 论

随着科技的不断提高和创新，HPLC的应用也逐渐广泛，并逐渐成为药物分析的主要技术手段.HPLC法使用高效固定相，流动相采用高压泵输送，在线进行检测，具有分离效能高、分析速度快、应用范围广、流出组分容易收集等优点，广泛应用于药物的含量测定.文章成功建立了同时测定金樱子中皂苷(19α-羟基亚细亚-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)和皂苷元(19α-羟基亚细亚酸)的高效液相色谱测定方法，面积归一化法计算化合物含量，测得皂苷最多为10.37 mg/g、皂苷元为5.36 mg/g.提取金樱子有效成分过程中考察了微波助提和超声辅助提取两种方法，文献记载微波助提有很高的得率，但其选择性强，对于同时多的提取两种极性的成分结果不理想，因此以超声法提取.为使总样中的两种成分尽可能多的被提取出来，并考虑两种化合物的极性，先以二氯甲烷甲醇液提取，再以甲醇为溶剂提取，结果中总样含量均很高.在提取过程中还考察了金樱子果实去籽与未去籽时两种成分的含量，结果表明去籽后皂苷及皂苷元的含量明显高于去籽前的，说明两种成分主要集中在金樱子果皮中.该法可以用于金樱子的质量控制.