一株高效甲烷氧化细菌生长条件优化研究

刘长风， 张晓宇， 王 椰， 段士鑫， 范文玉， 王 黎

(1.沈阳化工大学 环境与安全工程学院， 辽宁 沈阳 110142；2.武汉科技大学 资源与环境工程学院， 湖北 武汉 430081)

甲烷氧化细菌是可以以甲烷为唯一碳源和能源，通过生长代谢将甲烷氧化为二氧化碳的特殊革兰氏阴性菌，在环境中分布广泛[1-4].甲烷作为清洁能源的同时，也是引起全球气候变暖的主要温室气体之一.根据2015～2019年《中国生态环境状况公报》，我国全年平均气温日益升高，2009～2019年大气中甲烷的年平均绝对增量为5.5 μg/m3.甲烷作为仅次于二氧化碳的温室气体[5]，单分子增温势大约为二氧化碳的20～30倍，因此控制大气中甲烷的含量能有效缓解全球气候变暖[6-9].大量研究发现土壤中含有丰富的甲烷氧化细菌，是氧化大气中痕量甲烷的唯一途径[10-11].土壤甲烷氧化细菌对缓解全球气候变暖，维持大气甲烷平衡和碳循环平衡有着重要意义[12-13].

本文实验通过对5种不同类型土壤样品甲烷降解能力的对比研究，找出一种降解能力较强的土壤样品，并从中筛选出目的菌株，通过正交试验确定其最佳生长代谢条件,为甲烷氧化菌降解甲烷研究及甲烷氧化菌的培养优化提供基础数据.

1 实验材料和实验方法

1.1 培养基组成

实验采用无碳培养基[14-17]，无机盐为主要成分(NaNO3、KH2PO4·12H2O、Na2HPO4·12H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O).

1.2 菌种的筛选

取湖岸土壤、沙土土壤、森林土壤、花园土壤、稻田土壤样品各20 g装入培养瓶中，注入无菌CH4气体，密封[18]，35 ℃培养.每隔一定时间测定其中甲烷含量(采用气相色谱法测定，色谱柱为TDX-01，检测器为TCD)，考察其甲烷降解能力(以单位时间内甲烷的减少量为标准)，筛选出降解率最优的土壤样品.

在以甲烷为唯一碳源和能源的无机盐培养基中培养，利用土壤浸出液经平板涂布，摇瓶培养，平板划线，分离筛选出一株目的菌株并对其进行革兰氏染色[19,20]和扫描电镜观察[1,21].

1.3 菌种生长条件优化

在培养瓶中加入25 mL培养基，调节接种量、温度、pH、甲烷含量，密封振荡培养.每隔一定时间测定甲烷含量并计算降解率.空白试样培养基pH=7，不接种菌液，其他条件与试样相同.

1.4 甲烷的测定

实验采用气相色谱法进行CH4含量的测定[22-24]，色谱柱为TDX-01，氢火焰检测器(FID).具体测定条件：N230 mL/min，H230 mL/min，空气 300 mL/min，柱温90 ℃，进样温度100 ℃ ，检测温度200 ℃，出峰时间为 3.75 min.

1.5 菌株生长曲线测定

实验采用紫外可见分光光度法测定培养48 h时的菌悬液在600 nm处的吸光度.由于培养基中含有钙盐和镁盐等难溶物质，pH=7时培养基较浑浊，对吸光度影响较大，因此在测量OD值时将菌液pH调至5，使难溶的钙盐和镁盐溶解，迅速测定，此时测得的吸光度值完全是细菌的存在造成的[25].

2 结果与分析

2.1 不同土壤样品甲烷降解能力

不同土壤样品甲烷降解率随时间变化趋势如图1所示.

图1 不同类型土壤样品对甲烷的降解率

由图1可以看出：在相同培养条件下，实验所用5种土壤样品均具有降解甲烷的能力，但降解能力差异较大.培养68 h时，沙土土壤样品、森林土壤样品、花园土壤样品的甲烷降解率较低，均低于40 %；湖岸土壤样品、稻田土壤样品的甲烷降解能力最强，降解率可达90 %以上.稻田土壤样品在44 h内的甲烷降解率达94.8 %，远高于湖岸土壤样品的46.0 %.由此可知，稻田土壤样品的甲烷降解能力最强，降解速度快，故实验选用稻田土壤样品作为甲烷氧化细菌目的菌株分离的土壤样品.

2.2 菌种筛选结果

从稻田土壤样品浸出液中分离出一株目的菌株，命名为L08，革兰氏染色及扫描电镜观察结果如图2所示.

图2 菌株L08染色观察及扫描电镜形态

由图2(a)可以看出：菌株L08在固体斜面上划线培养7 d时斜面上长出脓泡状的透明单菌落，菌落为规则圆形，直径为2 mm左右，有光泽，边缘整齐，表面光滑.革兰氏染色表明该菌为革兰氏阴性菌，细菌形态呈杆状.由图2(b)可以看出：整个视野下菌体形态基本一致，均呈直杆状，有些杆状菌体略弯，菌体表面光滑，无鞭毛，两端光滑，菌体尺寸大小约为0.5 μm×1 μm.

2.3 菌种最优生长条件分析

2.3.1 细菌的接种量对甲烷降解能力的影响

按1.3项要求将细菌接种量分别控制为0.8 %、1.6 %、3.2 %、4.0 %、8.0 %、20.0 %、32.0 %(体积分数，下同)，甲烷含量为10.0 %(体积分数，下同)，培养基pH=7.0，试样置于35 ℃、150 r/min的培养箱中培养，每隔12 h检测一次甲烷含量，并计算甲烷的降解率，结果如图3所示.

图3 细菌接种量对甲烷降解率的影响

由图3可知：甲烷降解率与细菌接种量呈正相关，接种量在1.6 %～4.0 %时，反应64 h甲烷降解率均达到100 %；接种量大于等于8.0 %时，仅反应48 h甲烷就可完全耗尽.为更好地考察甲烷降解情况，选择最佳接种量为4.0 %.

2.3.2 培养温度对甲烷降解能力的影响

将pH=7.0的培养基、细菌接种量为4.0 %、甲烷含量为10.0 %的试样分别置于15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃，150 r/min的培养箱中培养，每隔6 h检测一次甲烷含量，并计算甲烷的降解率，结果如图4所示.由图4可知：温度对L08降解甲烷的能力有显著的影响.当反应28 h时，培养温度低于25 ℃，甲烷降解率最高达到8.9 %；当培养温度为55 ℃，甲烷降解率仅为4.8 %；当培养温度为35 ℃和45 ℃时，甲烷的降解率分别为达到57.1 %和62.5 %，且随反应时间的延长，降解率有明显上升的趋势，而其他温度培养下，甲烷降解率仍保持较低水平.由此可知，实验筛选出的甲烷氧化细菌最适宜生长温度为35～45 ℃，从节约能耗角度考虑，选择35 ℃为最适宜培养温度.

图4 温度对甲烷降解率的影响

2.3.3 pH对甲烷降解能力的影响

控制培养基pH分别为 2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、11.0，细菌接种量为4.0 %，甲烷含量为10.0 %，试样置于35 ℃、150 r/min的培养箱中培养，每隔24 h检测一次甲烷含量，并计算甲烷的降解率，结果如图5所示.

图5 pH对甲烷降解率的影响

由图5可知：在强酸条件下(pH=2.0、4.0、5.0)，甲烷降解率较低，反应156 h甲烷的降解率最大值仅为23.9 %；当pH=6.0～11.0时，甲烷的降解率均可在反应156 h之内达到100 %，其中pH=7.0时甲烷降解能力最强.故菌株L08在中性或弱碱性条件下的氧化能力较强，pH=7.0为最佳值.

2.3.4 不同甲烷含量对甲烷降解能力的影响

取25 mL无机盐培养基分别装于培养瓶中，注入无菌甲烷，培养瓶中甲烷含量分别为3.0 %、5.0 %、10.0 %、20.0 %、30.0 %、40.0 %(体积分数，下同)的无菌甲烷，培养基pH=7.0，细菌接种量为4.0 %，于35 ℃得到不同甲烷含量对降解率的影响曲线，结果如图6所示.由图6可知：随着甲烷体积分数的增加，降解率逐渐降低.这可能是由于培养瓶的容积有限，过多地增加甲烷含量势必会减少O2量，而甲烷的降解是需氧过程[26]，氧的浓度决定着甲烷氧化细菌利用氧的动力学特性以及甲烷单加氧酶(MMO)与氧结合的动力学性质[19].当甲烷含量为3.0 %时，反应36 h甲烷降解速率达89.0 %，当甲烷含量为10.0 %时，降解趋势较为平稳，且降解率在72 h还有继续上升的趋势.因此实验选择最佳的甲烷含量为10.0 %，既能为细菌提供足够的碳源，又能获得适合的O2量.

图6 不同甲烷含量对甲烷降解率的影响

2.4 培养条件正交试验

在培养条件单因素试验中，已确定菌株最适宜培养条件为：培养温度35 ℃、pH=7.0、菌悬液接种量4.0 %(体积分数)、甲烷含量10.0 %.采用正交优化试验方法，进一步考察其培养条件的综合因素对甲烷降解能力的影响.采用L16(45)正交试验设计[27-28]，以温度、pH、细菌接种量、甲烷含量为试验因素，甲烷降解率为指标，因素水平设计表见表1.正交试验结果如表2所示.

表1 正交试验因素水平

表2 培养条件正交试验结果

在单因素试验基础上，对培养条件进行正交优化，得出影响甲烷降解能力的因素序列为：pH>培养温度>甲烷含量>细菌接种量；从正交试验分析结果可以得出，正交试验确定的培养条件与单因素试验结果基本相同，说明各因素对甲烷降解能力及细菌生长的影响相对独立，仍采用细菌原培养条件，即pH=7.0、培养温度35 ℃、甲烷含量10.0 %、细菌接种量4.0 %.

2.5 细菌生长曲线测定

为更好地了解细菌的生长周期变化，按最优生长条件对细菌生长曲线进行测定，实验结果如图7所示.细菌的生长繁殖可分为4个时期：停滞期、对数期、静止期和衰亡期.由图7可以看出：L08在0～8 h时为停滞期，此时期细菌不立即生长而是经过一段时间适应才能在新的培养基中生长，且生长较缓，所以OD值变化不大；8～50 h为对数期，此时期细菌的生长速率最快，OD值随时间增加显著增大，OD值在50 h时增至最大；50～75 h 为静止期，此时期由于营养物质的消耗，培养基浓度降低，细菌代谢开始减慢，OD值开始下降；75 h之后为衰亡期，此时期由于培养基内营养物质消耗殆尽，细菌因缺乏营养而利用储存物质进行内源呼吸即自身溶解，所以OD值逐渐下降直至不变.

图7 细菌生长曲线

3 结 论

本研究通过对5种不同地区土壤样品进行甲烷降解效率试验得出某稻田土壤样品对甲烷的降解效率最高.利用稻田土壤样品浸出液进行菌种的分离，并纯化、鉴定，成功分离出一株高效降解的甲烷氧化菌株L08，革兰氏染色表明其为革兰氏阴性菌，电镜观察表明细菌形态多呈杆状，少量呈球状.通过试验研究发现甲烷氧化细菌L08的最优培养条件为培养温度35 ℃，pH=7.0，菌液接种量4.0 %，甲烷含量为10 %.目标菌株L08生长曲线测定发现：菌株培养8～50 h为对数期，细菌生长最旺盛、甲烷降解能力最强，且细菌的最佳转接时间不宜超过75 h，实际以3～5 d 内转接1次为宜.实验通过对甲烷氧化细菌的筛选分离及生长条件优化，为后续外在因素改变对甲烷氧化细菌降解甲烷能力的影响研究提供数据支撑，同时也为甲烷细菌氧化降解甲烷生成甲醇研究提供前期基础，为后续甲烷去除研究提供前期的技术支撑.