脂联素对血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心脏成纤维细胞增殖及ERK1/2信号的影响

刘立波，刘志坚，陈丽娜，刘晓红，李秀昌

1 山东第一医科大学第二附属医院心脏中心，山东泰安271000；2 山东第一医科大学研究生部

心肌纤维化（MF）是可逆转的病理过程，但尚缺乏明确的干预措施［1］。脂联素（APN）是具有广泛生物学效应的内源性激素，具有调节糖脂代谢、抗炎、抗动脉粥样硬化等生物学作用［2］。本课题组前期临床研究发现，血浆APN 水平与MF 程度有明确的相关性；并且经动物模型实验证实，APN 具有抑制MF发生发展的作用［3-4］。2014 年 10 月—2017 年 10 月，我们在前期研究基础上通过体外实验观察APN 对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的心脏成纤维细胞（CF）增殖及细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）信号的影响，为探讨APN抑制MF的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 清洁级1～3 日龄C57 小鼠10 只，雌雄不限，体质量（3.0 ± 0.6）g。亲代鼠购于山东大学实验动物中心，许可证号：SCXK（鲁）2013-0009，依托实验动物中心饲养、繁殖。本研究所涉及实验动物的相关处置均通过伦理学委员会审查。重组小鼠APN 购自武汉华美生物科技有限公司；AngⅡ购自成都西亚化工股份有限公司；抗Vimentin 抗体购自美国CST 公司；抗DDR2 抗体购自美国Santa Cruz 公司；HRP 标记的山羊抗兔抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；ERK1/2 兔抗鼠单克隆抗体、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）兔抗鼠单克隆抗体购自美国bioworld 公司；罗丹明和FITC 荧光素标记的山羊抗兔第二抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。酶标仪购自瑞士TECAN 公司；Western blotting 电泳仪、电泳槽购自美国伯乐Bio-Rad 公司；倒置荧光显微镜购自日本Olympus 公司；二氧化碳培养箱购自日本三洋公司。

1.2 原代小鼠CF 分离、培养及鉴定 取C57 乳鼠心肌组织，用冷胰酶联合Ⅰ型胶原酶消化法分离细胞，贴壁差分法获得纯化的小鼠CF，形态学及免疫细胞化学技术进行鉴定。将直径15 mm的圆形盖玻片置入24 孔板中。将细胞悬液滴在盖玻片上，至细胞悬液浸至盖玻片边缘。放入培养箱中培养至细胞贴壁，向培养板孔内加入培养液培养24 h。吸净各培养孔内的培养液，用PBS反复漂洗盖玻片2 min×2次。每孔加入4%多聚甲醛0.5 mL，室温下静置10 min。PBS 再次清洗盖玻片后，加入含0.2%Triton X-100 的PBS 溶液透化固定后的细胞10 min；加入适量PBS，摇床上轻轻摇晃5 min，重复操作3次。洗净PBS，将细胞爬片迅速转移至24 孔板中。加入山羊血清，于37 ℃封闭30 min。将培养板置于湿盒中，分别加入兔抗鼠Vimentin 抗体及DDR2 抗体25 μL（用3%BSA 1∶100 稀释）。将湿盒放入4 ℃冰箱孵育过夜。加入PBS，摇床上漂洗5 min，重复3次，吸去漂洗液液体；分别加入罗丹明和FITC 荧光素标记的山羊抗兔第二抗体（1∶100 稀释），37 ℃避光孵育20 min。用PBS将盖玻片洗3次，各5 min，吸干。加入少量DAPI 染液，室温放置3～5 min。吸干DAPI 染液，PBS 漂洗 3 min×3 次。弃掉漂洗液，取出细胞爬片，将爬片细胞面朝下盖在滴有封片液的载玻片上，指甲油封片。荧光显微镜（×200）下观察，拍照。

1.3 细胞分组及干预 取2～4 代CF 进行实验，用无血清培养基饥饿处理12 h后随机分为5组。对照组用无血清的DMEM 培养基培养；AngⅡ组用含1×10-7mol/L AngⅡ的 DMEM 培养基培养；APN 低、中、高剂量组先分别用1、5、25 μg/mL APN 干预1 h，然后加含1×10-7mol/L AngⅡ的DMEM 培养基培养。均培养24 h后收集细胞。

1.4 CF增殖能力检测 采用MTT法。胰蛋白酶消化对数期原代培养的CF，消化、收集细胞沉淀，培养基重悬细胞，调整细胞至5×104/mL。96孔板每孔加入细胞悬液100 μL，每组细胞至少做3 个复孔。继续培养，待细胞长至约70%融合时，将原培养液吸弃，每孔加入DMEM 培养基 100 μL 同步化处理24 h。吸掉培养基，分组加药（同1.3）。保留原培养液，向每孔加入5% MTT 溶液10 μL，放入培养箱中继续培养4 h。去掉上清液，每孔加入DMSO 150 μL，将培养板置于摇床上低速振荡10 min。上机，用酶标仪检测490 nm波长处吸光度（OD）值。

1.5 CF 内 ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达检测及 p-ERK/ERK测算 采用Western blotting法。取6孔板中培养的细胞加入细胞裂解液。用细胞刮将细胞刮下，混合液冰浴20～30 min，12 000 r/min 4 ℃离心15 min（离心半径13.5 cm），将上清液转移至新的EP 管中。各组中取适量样本BCA 蛋白定量。剩余样本按照蛋白溶液与上样缓冲液3∶1 的比例稀释。混匀，100 ℃水浴5～10 min，使蛋白解链、变性。冷却至室温后，12 000 r/min 离心 2～5 min，取上清上样。配胶、灌胶、上样、电泳、转膜（湿转，恒压100 V，1 h）。PVDF 膜放入5%脱脂奶粉或5%BSA 的封闭液中，置于水平摇床上室温孵育1 h。将PVDF 膜和一抗（兔抗鼠ERK1/2、p-ERK1/2、GAPDH 抗体，3%BSA 1∶100稀释）溶液移入自封袋中，4 ℃水平缓慢摇晃过夜。将PVDF 膜取出，置于TBST 洗膜缓冲液中，室温漂洗10 min，共洗3次。1∶5 000稀释辣根过氧化物酶标记的二抗。将PVDF 膜转移至盛有二抗溶液的自封袋中，室温、摇晃孵育1 h。将PVDF膜取出，置于TBST洗膜缓冲液中，室温漂洗10 min，共洗3 次。暗室中显影、定影，X 光胶片扫描成像。用Image J软件计算各条带灰度值，Graph pad prism5软件绘图。目标蛋白相对表达量=目标蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料符合正态分布用表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠原代心脏CF 鉴定结果 小鼠原代心脏CF 的形态学特征：经消化分离后获得的原代心肌混合细胞呈大小不一的球形，其中心脏CF 先贴壁，约60 min 后心脏 CF 基本贴壁。2～3 d 基本铺满培养瓶底，此时细胞生长排列紧密，呈不规则形或长梭形，胞质透明，有2～3 个核，部分呈交叉生长，无自发性搏动。细胞生长至70%～80%可传代，传至第4 代细胞开始出现衰老，状态变差。心脏CF 纯度：经分离纯化后，原代培养的心脏CF 特异性抗原DDR2（FITC 标记，绿色荧光）及Vimentin（罗丹明标记，红色荧光）表达均阳性，阳性细胞表达率均接近100%。

2.2 各组心脏CF 增殖能力比较 对照组、AngⅡ组、APN 低剂量组、APN 中剂量组、APN 高剂量组OD 值 分 别 为 0.17 ± 0.02、0.20 ± 0.07、0.18 ±0.11、0.17 ± 0.10、0.16 ± 0.17。与对照组比较，AngⅡ组 OD 值高（P＜0.05）；与 AngⅡ组比较，各APN组OD值低（P＜0.05）；各APN组OD值比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。

2.3 各组心脏 CF 中 ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白表达及p-ERK/ERK比较 见表1。

表1 各组心脏CF中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达及p-ERK/ERK比较（）

表1 各组心脏CF中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达及p-ERK/ERK比较（）

注：与对照组比较，ΔP＜0.05；与AngⅡ组比较，*P＜0.05。

组别对照组AngⅡ组APN低剂量组APN中剂量组APN高剂量组p-ERK/ERK 0.36±0.04 0.70±0.16Δ 0.58±0.12 0.59±0.12 0.44±0.09*ERK1/2 0.65±0.05 0.70±0.10 0.75±0.11 0.72±0.08 0.75±0.08 p-ERK1/2 0.24±0.01 0.49±0.04Δ 0.43±0.04 0.42±0.56 0.33±0.04*

3 讨论

心脏CF 是心肌组织最主要的间质细胞，是MF发生发展的主要效应细胞［5］。在MF 相关领域的基础研究中获得稳定的、纯度高、活力旺盛的心脏CF有重要意义。既往对于心脏CF 的分离主要有机械分离法和酶消化法。其中机械分离法由于需要反复吹打对细胞损伤较大，现已少用。实验中多采用的酶消化法主要以单一温胰酶消化法为主，但细胞获得率低。本研究采用冷胰酶联合Ⅰ型胶原酶的冷胰酶—胶原酶联合消化法大大提高了细胞的获得率，节约了实验成本。同时利用心脏CF贴壁快、增殖迅速的特点，结合贴壁差分法，得到的心脏CF 纯度接近100%。

一项运用流式细胞术分析小鼠心脏细胞构成的研究表明，45%的细胞是非肌细胞，其中CF占主导，55%是肌细胞［6］。这些心脏CF 对于心脏的结构和机械功能的维持至关重要。CF 协调胶原蛋白网络的产生和重塑，而胶原蛋白网络对于保证心肌的传导性和节律性至关重要［7-8］。心肌在梗死、压力超负荷等因素刺激下，心脏CF 转分化为肌CF。肌CF 具有强大的胶原分泌功能，并且有一定的收缩功能。这是MF 发生的初始环节，也是MF 最关键的细胞学事件。此外，肌CF 大量增殖并在心肌组织中聚集［9］。因此 CF 或肌 CF 增殖能力可部分反映 MF 的发生。本研究结果显示，APN 能够抑制AngⅡ诱导的CF 增殖，表明APN 可能通过抑制CF 的增殖发挥抗MF 作用。研究的不足之处为该实验未检测心脏CF 的转分化及胶原合成情况，以更加全面观察APN对心脏CF的影响。

无论何种病因导致的MF，肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）的激活在纤维化的心脏中始终存在。在受损心肌中浸润的巨噬细胞和CF 产生的肾素、血管紧张素转换酶是生成AngⅡ所必需的分子［10］。局部释放的AngⅡ通过直接和TGF-β 介导的间接作用，对心脏CF 起强效刺激。体外研究表明，AngⅡ刺激心脏CF 增殖，并通过AT1 受体增强胶原合成活性［11-13］。本研究结果显示，AngⅡ能够体外诱导心脏CF增殖，与既往研究结论一致。经过不同浓度的APN 作用后，AngⅡ的促增殖作用减弱。表明，APN 可能通过拮抗RAAS 系统的激活，发挥抗纤维化作用。

MAPK 通路在细胞生长、凋亡和转分化中发挥重要作用［14-15］。迄今，在哺乳动物体内发现至少有6种主要的MAPK 亚型。其中，ERK1/2 和p38 MAPK是与增殖、纤维化相关的信号激酶［16-17］。并且ERK1/2 和 p38 MAPK 是与 AngⅡ诱导的 MF 关系最为密切的 MAPK 信号通路［18］。AngⅡ作用于膜上的AT1R，顺序激活 MAPK 的上游元素 GTPase、Ras、Raf，进而通过MAPK 激酶的激酶（MAPKKK）-MAPK激酶（MAPKK，MEK）-MAPK 保守的三级激酶级联反应，使ERK1/2 磷酸化而激活，ERK1/2 激活后从胞质进入核内，调节转录因子的活性，促进c-fos、cjun、c-myc等癌基因的表达，进而引起细胞增殖和生长反应，从而介导心肌重构［19-20］。在此通路中ERK1/2 的活化是将信号从胞膜受体转导至核内的关键。本研究中，在AngⅡ刺激下，p-ERK1/2 蛋白高表达，与既往文献一致；同时，AngⅡ诱导升高的ERK1/2 磷酸化能被APN 抑制。说明APN 拮抗AngⅡ诱导的心脏CF 增殖可能与MAPK/ERK 信号通路有关。但未用ERK1/2 特异性的阻断剂与APN 对比，进一步明确APN的作用靶点。

综上所述，APN 可能通过抑制心脏CF 增殖、ERK1/2 信号活化而发挥抗MF 的作用，为APN 应用于抗MF领域提供了佐证。