长链非编码RNA LINC00943对结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞迁移能力的影响及机制

朱杰华 杜文胜 陈莉 陈光红 罗军敏

(遵义医科大学 1附属医院医学检验科，贵州 遵义 563000；2检验医学院；3基础医学院免疫学教研室)

肺结核(TB)是一种由结核分枝杆菌侵及肺部而引起的慢性传染病，在我国患病率较高，近年来由于耐药菌株数量的不断增加，给TB治疗带来新的挑战〔1〕。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的RNA分子，可参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程〔2〕。有研究发现LINC00943参与多种肿瘤发生发展，可能成为潜在的治疗靶点〔3〕。然而，LINC00943在TB中的作用机制尚未明确。微小RNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，可通过靶向作用于靶基因的3′-UTR，在转录后水平调控基因表达，且可调控细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程〔4〕。既往研究表明，miRNA在宿主-致病原作用网络中发挥作用，可调节感染后细胞免疫反应及限制细菌增殖〔5〕。已有研究发现miR-125b-5p在TB患者和结核分枝杆菌感染的细胞中高表达，参与TB的发生发展〔6〕。本研究通过使用结核分枝杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞构建TB体外细胞模型，旨在探讨LINC00943对TB体外细胞模型细胞迁移能力的影响，为TB治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1细胞与主要试剂 小鼠巨噬细胞(MH-S细胞系)和结核分枝杆菌(H37Ra菌株)均购自美国ATCC；胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素及RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司；LINC00943的野生型(LINC00943-WT)和突变型(LINC00943-MUT)荧光素酶报告载体均由北京易科潘搏生物科技有限公司构建；pmirGLO荧光素酶报告系统质粒购自上海海吉浩格生物科技有限公司；LINC00943小干扰RNA(si-LINC00943)及阴性对照小干扰RNA(si-NC)由吉玛生物科技有限公司合成；miR-125b-5p模拟物(miR-125b-5p mi)及阴性对照寡核苷酸(miR-NC)均购自上海吉玛制药技术有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因载体(pmirGLO载体)和逆转录试剂盒均购自美国Promega公司；miScfipt SYBR Green PCR Kit miRNA定量扩增反应体系，购自德国Qiagen公司；一抗热休克蛋白(HSP)65(ab92416)，二抗山羊抗鼠IgG H&L(FITC)(ab6785)均购自英国Abcam公司；ProFlex PCR 系统购自美国ThermoFisher公司；FV3000激光扫描共聚焦显微镜购自日本Olympus公司。

1.2细胞培养 将小鼠巨噬细胞MH-S置于含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，在37℃，5% CO2培养箱中培养。

1.3模型构建及转染前分组 将MH-S细胞随机分为对照组和模型组，对照组常规培养；模型组细胞使用感染复数为10的H37Ra菌株感染，在感染后4 h用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次，并加入新鲜的完全培养基中。

1.4细胞转染及转染后分组 使用LipofectamineTM2000转染试剂并根据操作说明将si-NC、si-LINC00943、miR-NC miR-125b-5p mi转染至MH-S细胞，并依次设为si-NC组、si-LINC00943组、miR-NC组、miR-125b-5p mi组，其中miR-NC组、miR-125b-5p mi组仅用于双荧光素酶实验。

1.5激光共聚焦显微镜下观察MH-S细胞感染细菌情况 细胞感染方法同1.3。感染H37Ra后，加入4%多聚甲醛固定细胞 15 min，滴加山羊血清封闭液室温封闭20 min，加入一抗(稀释度1∶1 500)4℃过夜，而后加入绿色荧光标记的二抗(稀释度1∶500)室温孵育2 h，封片后在激光共聚焦显微镜下观察并拍照，使用 Image J软件分析细菌荧光强度。

1.6划痕愈合实验检测细胞迁移能力 将细胞接种于6孔板，当细胞生长达到100%融合度时，用10 μl无菌枪头在6孔板中央划痕，用PBS冲洗细胞残渣2～3次，在无血清培养基，37℃，5% CO2条件下继续培养，分别于0、24 h在显微镜下观察细胞划痕愈合情况。细胞迁移率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。每组细胞做3个平行孔，实验重复3次。

1.7双荧光素酶实验验证LINC00943与miR-125b-5p的结合关系 采用生物信息软件starbase在线预测LINC00943的靶基因，结果发现LINC00943和miR-125b-5p含有互补结合位点，随后对二者的靶向关系进行验证。分别将含有LINC00943-WT和LINC00943-MUT的荧光素酶报告基因载体转染进MH-S细胞中，随后将miR-125b-5p mi或miR-NC共转染至MH-S细胞。转染后48 h，收集各组细胞检测荧光素酶活性。

1.8实时荧光定量PCR检测miR-125b-5p的表达量 取MH-S细胞，按照说明书要求采用TRIzol试剂提取总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用miScfipt SYBR Green PCR Kit miRNA定量扩增反应体系进行实时荧光定量PCR反应。实时PCR条件为：95℃预变性8 min，随后以93℃ 15 s、 55℃ 30 s和72℃ 30 s进行40个循环，使用2-ΔΔCt方法计算miR-125b-5p的相对表达量。

1.9统计学分析 采用SPSS25.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1敲低LINC00943对MH-S细胞内细菌荧光强度和细胞感染比例的影响 与对照组相比，模型组细胞内细菌荧光强度及细胞感染比例显著增加(P<0.01)；与si-NC组相比，si-LINC00943组细胞内的细菌荧光强度及细胞感染比例显著降低(P<0.05，P<0.001)，说明MH-S细胞感染H37Ra菌株的模型建立成功。见图1和表1。

表1 各组细菌荧光强度比较

2.2敲低LINC00943对MH-S细胞迁移能力的影响 与对照组〔(23.54±2.67)%〕相比，模型组细胞迁移率〔(64.15±2.32)%〕显著提高(P<0.001)；与si-NC组〔(62.77±1.64)%〕相比，si-LINC00943组细胞迁移率〔(43.56±4.75)%〕显著降低(P<0.01)，见图2。

图2 划痕愈合实验检测细胞的迁移(×100)

2.3双荧光素酶实验验证LINC00943与miR-125b-5p的结合关系 starbase数据库预测LINC00943与miR-125b-5p存在互补结合位点，见图3。双荧光素酶报告实验结果显示，与miR-NC组相比，miR-125b-5p mi组中含LINC00943-WT荧光素酶报告质粒的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，而miR-125b-5p mi组中含LINC00943-WT荧光素酶报告质粒的荧光素酶活性无差异(P>0.05)，见表2。

表2 各组荧光素酶活性比较

图3 LINC00943含有与miR-125b-5p互补的结合位点

2.4LINC00943对miR-125b-5p表达水平的影响 qRT-PCR实验结果显示，si-LINC00943组中miR-125b-5p的表达水平(1.56±0.09)较si-NC组(0.98±0.11)显著增加(P<0.01)。

3 讨 论

结核分枝杆菌是一种胞内寄生菌，而肺泡巨噬细胞是其主要的宿主和靶细胞〔7〕。近年来LncRNA的生物功能被探索与研究，发现其功能和基因表达与多种疾病的发生发展密切相关〔8〕。如在帕金森病中，敲低LINC00943可提高MPP+诱导SK-N-SH细胞的细胞活力及抑制细胞凋亡，并通过miR-15b-5p/RAB3IP轴减轻炎症性和氧化性神经元损伤〔9〕；其他研究报道也发现，敲低LINC00943可通过调节miR-7-5p/CXCL1212轴减轻MPP+诱导的神经元损伤，LINC00943可作为帕金森病的治疗靶点〔10〕。另外，LINC00943在胃癌中高表达，并与胃癌患者的不良预后相关，敲低LINC00943可抑制胃癌细胞增殖，通过靶向miR-101-3p调节胃癌细胞增殖和化学敏感性〔11〕。本研究结果说明敲低LINC00943对MH-S细胞的染菌能力及迁移能力均有抑制作用。

LncRNA可作为miRNA的“分子海绵”而降低miRNA丰度，并与miRNA竞争性结合〔12,13〕。miR-125b-5p是一类miRNA，研究表明其可作为抑癌基因参与多种疾病的发生发展〔14〕。既往研究表明miR-125b-5p在结核分枝杆菌BCG感染的RAW264.7巨噬细胞中显著上调，并通过靶向DRAM2抑制细胞自噬〔15〕。本研究发现LINC00943可与miR-125b-5p靶向结合，且敲低LINC00943可显著促进miR-125b-5p的表达。