LncRNA BLACAT1通过抑制miR-519d促进宫颈癌细胞的增殖、迁移与侵袭

郭改艳 舒丽莎

(1河北北方学院，河北 张家口 075000； 2河北北方学院附属第一医院妇产科)

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，在女性恶性肿瘤中其发病率和死亡率仅次于乳腺癌〔1〕。尽管在临床上采用先进的放射和化学疗法技术，由于宫颈癌患者局部复发和远处转移，目前患者的预后仍然不理想〔2〕。近年来，长链非编码RNA(LncRNAs)是一组长度超过200个核苷酸的RNA，缺乏蛋白质编码能力，可以调节基因转率、翻译和翻译后修饰〔3〕。LncRNAs参与许多细胞功能，包括增殖、分化、迁移、侵袭和凋亡〔4〕。LncRNAs在肿瘤发生和发展中的生物学作用已被广泛研究，一些LncRNA可作为预测预后或有望成为恶性肿瘤诊断的生物标志物〔5,6〕。LncRNA BLACAT1在多种癌症中异常表达，包括膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、结直肠癌和宫颈癌等〔7～9〕。有荟萃分析表明BLACAT1高表达可预测总生存期缩短、TNM晚期、肿瘤分极差及淋巴结转移〔10〕。LncRNA BLACAT1在卵巢癌组织和细胞中过表达，敲降BLACAT1通过调节Wnt/β-catenin通路抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭〔11〕。LncRNA BLACAT1在宫颈癌的发生与发展的生物学作用尚未阐释清楚。

miR-519d在宫颈癌组织和细胞中低表达。过表达miR-519d通过靶向HIF-2α抑制宫颈癌细胞增殖，促进细胞凋亡〔12〕。敲降miR-519d通过靶向Smad7促进宫颈癌的发生和转移〔13〕。敲降BLACAT1通过调节miR-519d/Wnt/β-catenin通路抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭〔11〕。目前，关于BLACAT1通过调节miR-519d影响宫颈癌细胞生物学功能的研究尚未报道。本研究旨在探讨BLACAT1在宫颈癌细胞中的表达和生物学功能的分子作用机制，为临床宫颈癌早期诊断和治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1组织样本 收集2018年1月至2019年10月12例来自河北北方学院附属第一医院妇产科的宫颈癌组织及配对的癌旁组织样本，保存在液氮中。所有患者已确诊为宫颈癌，且手术前未进行放化疗等新辅助治疗，患者家属签署本研究知情同意书，并经伦理委员会同意。

1.2细胞系、主要试剂与仪器 人正常宫颈上皮细胞(End1/E6E7)和人宫颈癌细胞系(C33a、Caski、SiHa和HeLa)均购于中科院上海细胞研究所。NC shRNA、LncRNA BLACAT1、NC、miR-519d mimics转染试剂盒购于上海吉玛生物公司。DMEM培养基和胎牛血清购于美国 Hyclone公司。Trizol试剂、SYBR Green Qpcr Super Mix、Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司。Transwell细胞板、基质胶为美国BD公司。CCK-8试剂盒购于武汉华美公司。双荧光素酶报告基因试剂盒和报告基因载体购于Promega公司。抗体E-钙黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)购于美国CST。酶标仪、PCR仪、凝胶成像仪均于买美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3细胞培养与转染 人正常宫颈上皮细胞(End1/E6E7)和人宫颈癌细胞系(C33a、Caski、SiHa和HeLa)添加含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，放入CO2、37℃恒温培养箱中培养。待细胞生长到对数生长期时，传代，接种6孔板，以备转染实验。

细胞转染实验Lipofectamine 2000慢病毒包装质粒 NC shRNA、LncRNA BLACAT1、NC、miR-519d mimics分别转染到HeLa细胞中。

1.4实时荧光定量PCR 收集宫颈癌组织及癌旁组织和细胞，用TRizol法提取总RNA。逆转录得到cDNA作为模板，SYBR Green Qpcr Super Mix 进行RT-PCR检测。采用2-△△Ct法计算差异表达量。引物序列为BLACAT1-正义链： 5′-GCTGGAGTTTGTCCTGTCT-3′，BLACAT1-反义链： 5′-CTCATCGCCACCTGTTAT-3′；U6 snRNA-正义链:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 snRNA-反义链:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；hsa-miR-519d-正义链：5′-AAGTGCCTCCCTTTAGAGTGGT-3′，hsa-miR-519d-反义链： 5′-GGTGCA-GGGTCCGAGGTAT-3′。

1.5CCK-8检测细胞增殖 将对数生长期的HeLa细胞接种于96孔板，每个实验设计3个复孔。分组转染后，在24、48、72 h加入10 μl CCK-8试剂，放回培养箱，2 h后拿出进行酶标仪检测450 nm的吸光度(OD)值。

1.6Transwell检测细胞迁移与侵袭 将转染过的HeLa细胞，接种在Transwell小室的上室，细胞浓度为3×105个/ml，下室加10%胎牛血清的培养基，培养48 h取出小室，用棉签擦去上室的细胞，进行结晶紫染色，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，干燥，200倍倒置显微镜观察。细胞侵袭能力在小室里加入基质胶。其他步骤与迁移实验步骤相同。

1.7Western印迹检测蛋白表达 细胞转染后，用细胞蛋白提取试剂盒提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量。计算等量蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，然后将蛋白转膜。加入5%脱脂牛奶封膜1 h，加入一抗放4℃冰箱过夜，一抗浓度E-cadherin(1 000∶1)、N-cadherin(800∶1)、Vimentin(1 500∶1)、GAPHD(500∶1)。洗膜，加入二抗，洗膜，加入化学发光剂进行显影蛋白。采用Image J软件分析蛋白条带的灰度。

1.8荧光素酶报告基因验证LncRNA BLACAT1与miR-519d靶向关系 HeLa细胞转染后处于对数生长期时接种于24孔板，培养24 h后，扩增LncRNA BLACAT1与miR-519d结合片段并导入到荧光素酶载体中构建野生型质粒。将其结合片段进行核苷酸突变，即为突变型质粒。参照Lipofectamine 2000操作说明进行转染NC，miR-519d mimic，培养24 h后，收集细胞。根据双荧光素酶试剂盒说明书进行染色，酶标仪检测萤火虫和海肾荧光活性值。

1.9统计学分析 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1LncRNA BLACAT1在宫颈癌组织中的表达 与癌旁组织(1.02±0.09)相比，LncRNA BLACAT1在宫颈癌组织中的mRNA表达水平(6.13±0.27)升高，差异有统计学意义(t=62.20，P=0.000)。

2.2LncRNA BLACAT1在宫颈癌细胞系中高表达 与End1/E6E7细胞(1.00±0.06)相比，LncRNA BLACAT1在宫颈癌细胞系(C33a、SiHa、Caski和 HeLa)中mRNA表达水平(2.19±0.20、3.53±0.17、4.27±0.21、5.09±0.19)显著升高(t=8.34、17.73、22.92、28.66，均P=0.000)，且HeLa细胞中LncRNA BLACAT1的mRNA表达水平最高。

2.3敲降LncRNA BLACAT1抑制宫颈癌细胞增殖 与NC shRNA组(1.03±0.05)相比，BLACAT1 shRNA组中LncRNA BLACAT1 mRNA表达水平(0.41±0.02)显著降低(t=19.94，P=0.000)。与NC shRNA组相比，BLACAT1 shRNA组在24、48、72 h时细胞活力显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 敲降LncRNA BLACAT1对宫颈癌细胞活力的影响

2.4敲降LncRNA BLACAT1抑制宫颈癌细胞迁移与转移 与NC shRNA组相比，BLACAT1 shRNA组中HeLa细胞迁移与侵袭细胞数目降低，差异有统计学意义(均P=0.000)。见图1，表2。

表2 敲降LncRNA BLACAT1对宫颈癌细胞迁移与侵袭的影响个)

图1 敲降LncRNA BLACAT1对宫颈癌细胞迁移与侵袭的影响(结晶紫染色，×200)

2.5各组N-cadherin、Vimentin及E-cdaherin蛋白表达比较 与NC shRNA组相比，BLACAT1 shRNA组N-cadherin和Vimentin蛋白水平显著减少，E-cadherin蛋白水平显著增加(P<0.01)。见表3。

表3 敲降LncRNA BLACAT1后对宫颈癌细胞内E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量的影响

2.6LncRNA BLACAT1靶向调节miR-519d 通过Stabase 2在线分析软件预测miR-519d可能是LncRNA BLACAT1的靶基因。野生型组(WT)中，过表达miR-519d 荧光素酶活性(0.45±0.02)显著低于NC组(0.98±0.03)，差异有统计学意义(t=25.46，P=0.001)。与NC shRNA组(0.49±0.11)相比，BLACAT1 shRNA组中miR-519d表达水平(0.98±0.12)显著增加，差异有统计学意义(t=5.214,P=0.003)。

3 讨 论

迄今为止，在宫颈癌的预防、诊断和治疗方面取得了相当大的进展〔14〕。但由于宫颈癌的转移和复发，传统手术、放射治疗和化疗对患者的治疗仍然有限〔15〕。如果宫颈癌患者可得到早期诊断和早期治疗，5年生存率可高达90%〔16〕。然而，宫颈癌的早期症状并不明显。70%的宫颈癌患者都是女性，中晚期约占总发病率的31%，宫颈癌经治疗后会复发，且预后极差〔17,18〕。因此，寻找有效的治疗靶点和预后标志物是宫颈癌诊断和治疗的迫切需要

LncRNAs是一种新的基因表达调控因子，在各种疾病病理生理过程中起关键作用。近年来，LncRNAs已成为多种人类恶性肿瘤的研究热点〔19〕。先前研究表明LncRNA BLACAT1在多种肿瘤中过度表达，如乳腺癌〔20〕、头颈鳞癌〔21〕和骨肉瘤癌〔22〕。然而，BLACAT1在宫颈癌中的作用尚不清楚。目前发现BLACAT1在宫颈癌组织和细胞中的表达异常增加。LncRNAs在细胞增殖、迁移和侵袭中的作用已被广泛报道〔23,24〕。据报道在小鼠体内，BLACAT1基因敲除降低了胃癌肿瘤的生长〔25〕。研究报道BLACAT1基因敲除可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔26〕。本文结果表明，敲降BLACAT抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，表明BLACAT1在癌症进展中起抑癌基因的作用。

LncRNAs可能作为miRNAs发挥作用“海绵”来减弱不同miRNAs的水平。例如：LncRNA LIPE-As1在宫颈癌组织中过表达，可以预测宫颈癌的生存率低，通过调节miR-195-5p/MAPK促进癌细胞增殖与转移〔27〕。有研究报道过表达miR-519d通过靶向HIF-2α抑制宫颈癌细胞增殖，促进细胞凋亡〔12〕。敲降miR-519d通过靶向Smad7促进宫颈癌的发生和转移〔13〕。因此，敲降BLACAT1可能通过调节miR-519d抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。

综上，BLACAT1在宫颈癌组织和细胞中表达上调，通过靶向负调节miR-519d参与宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭功能。本研究为BLACAT1在宫颈癌中生物学功能提供了理论基础，为宫颈癌早期诊断和治疗提供科学依据。