抗肿瘤坏死因子-α对大鼠脑缺血再灌注损伤的干预作用

杨晓炜 刘凤海 刁慧杰 石文秀 姚立岩

(牡丹江医学院公共卫生学院，黑龙江 牡丹江 157011)

缺血性脑卒中常伴不同程度的感觉、运动和认知功能等障碍，其致残和致死性很高〔1，2〕。缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中的重要病理过程。炎症反应是造成缺血再灌注损伤的重要机制〔3〕。肿瘤坏死因子(TNF)-α是近年新发现的具有多种生物学效应的炎症因子，参与缺血性脑卒中的炎症免疫过程。TNF-α 是炎症反应的始动因子，在脑缺血再灌注早期，TNF-α合成和释放增加是促进缺血性脑卒中形成的重要原因〔4〕。因此，抗TNF-α等抗炎治疗成为缺血性脑卒中治疗的研究热点。然而，抗炎治疗在临床实践中却常常达不到预期效果。如能探明 TNF-α 在脑缺血中损伤保护的平衡点及关键点，让其在最适宜的时间发挥其最有利的作用对临床缺血性脑卒中的治疗将极为重要〔5〕。

抗TNF-α干预方法很多，益赛普〔注射用重组人Ⅱ型TNF受体-抗体融合蛋白(rhTNFR：Fc)〕是目前国内使用最广泛的一种 TNF-α 拮抗剂，益赛普是细胞表面 TNF-α 受体的竞争性抑制剂，可以抑制 TNF-α 生物活性，从而阻断 TNF-α介导的细胞反应〔6〕。益赛普在临床上已长期应用，其抗炎效果及安全性比较可靠。本研究在建立了大鼠局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO/R)〔7〕基础上，以益赛普作为抗TNF-α的干预用药，于大鼠脑缺血再灌注不同时程尝试用益赛普干预缺血再灌注后的脑损伤，并将各时点干预效果与常规用药阿托伐他汀对比，论证最有效的干预时机及干预效果。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级健康老年雄性SD大鼠，224只，体重300～350 g。 温度(25±1)℃，湿度50%±10%，自由觅食饮水，适应性饲养7 d后进行实验。

1.2主要仪器和试剂

1.2.1主要仪器 -80℃冰箱(Haier 青岛)、-20℃冰箱(Haier 青岛)、4℃低速离心机(AXTDL5M-II 上海)、酶标仪(Bio-Rad Laboratories 上海)、微量加样器(Research plus 德国)、分析天平(FA1204B 上海)、干燥箱(DZF 上海)。

1.2.2主要试剂 注射用重组人Ⅱ型TNF受体-抗体融合蛋白 (上海中信国健药业有限公司)、阿托伐他汀：纯度大于99.19%(广东阳江制药厂有限公司)、大鼠TNF-α酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、 TTC染色剂(Solarbio 北京索莱宝科技有限公司)、多聚甲醛、甲醛、磷酸盐缓冲液(PBS)、生理盐水。

1.3大鼠MCAO/R模型制作 大鼠禁食12 h且禁水6 h后，10%的水合氯醛(0.30 ml/100 g)腹腔注射麻醉，采用改良MCAO法，将直径为0.26 mm的线栓预先经多聚赖氨酸浸渍，60℃烘干处理，处理后置入大鼠右侧颈内动脉(CA)18～22 mm(根据动物大小调整插入线栓的深度)，阻塞右侧大脑中动脉，记录梗阻开始时间，固定外端的线栓缝合皮肤并标记留在皮肤外面线栓。大鼠未苏醒时注意保暖。缺血2 h后，拔出线栓约10 mm，确保线栓退至颈总动脉分杈处，实现脑缺血再灌注。模型成功的标志：参照Longa等〔8〕的方法，对各组进行神经行为学评分：0分，无神经缺损症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，出现同侧Horner征，行走时向对侧转圈；3分，站立不稳，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。评分在1～3分的大鼠认为模型制作成功，纳入实验分组。操作过程中出现迷走神经损伤、线栓置入失败或蛛网膜下隙出血、术后24 h 内出现感染的大鼠为造模失败。造模失败按照随机抽样原则补齐动物并重新造模。

1.4动物分组 随机将大鼠分为6组：模型组16只，造模后3、6、12、24、48、72 h神经评分；内眦取血，测血清TNF-α；72 h取脑，其中8只测脑梗死体积比，另外8只测脑含水量。健康对照组16只，除不造模外其他操作同模型组。假手术组16只，除手术过程不插线外其他操作同模型组。预注射组16只，模型制备前0.5 h大鼠皮下注射益赛普0.6 mg/kg。TNF-α干预组80只，造模后将大鼠随机分为5个亚组，每组16只。分别为造模后3、6、12、24、48 h组。每组于相应时点一次性经皮下注射益赛普0.6 mg/kg进行干预。他汀干预组80只，分组方式及指标测定同TNF-α干预组。干预方式为经腹腔注射阿托伐他汀20 mg/kg。

1.5神经行为评分 脑缺血再灌注后3、6、12、24、48、72 h分别对各组进行神经功能损害评分，评分标准参照Longa等〔8〕的方法，提起鼠尾离开地面33 cm左右，观察两前肢的伸展状况；大鼠置于地面，观察其行走情况。分数越高，说明其神经行为损伤越重。

1.6梗死范围的确定 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.30 ml/100 g)〔9〕，断头取脑。将脑组织标本置于-20℃冰箱中20 min取出，切去额端1.0 mm，由前向后每隔2.0 mm作冠状切片，共切5片。放置于1%TTC磷酸缓冲液(0.23 mol/L，pH7.5)中，37.5℃避光孵育，每隔15 min翻面一次，共孵育30 min。正常组织显示出红色，梗死组织显示为白色。染色后数码相机拍照，使用ImageJ图像分析系统计算梗死体积。大鼠脑梗死体积百分比=(正常侧大脑半球体积-梗死侧非梗死区大脑半球的体积)/正常侧大脑半球体积〔10〕。

1.7脑组织含水量测定 冰浴中断头，取右脑，除去小脑和低位脑干、嗅球，立即用分析天平称其湿重。置160℃烤箱内，24 h后称干重，以计算含水量。公式如下：含水量=(湿重-干重)/湿重×100%〔11〕。

1.8血样处理及炎症因子的测定 动物处死前各时点采用眼内眦静脉丛取血，每次取血1～2 ml，室温静置2 h左右，将血样4℃3 000 r/min，离心10 min。分离出血清，置于-80℃冰箱保存。检测时按试剂盒说明书采用ELISA检测血清TNF-α。

1.9统计处理 应用SPSS19.0 软件进行t检验，方差分析，单因素方差分析，LSD-t检验，Dunnett-T检验。

2 结 果

2.1益赛普对脑缺血再灌注损伤的预防作用 大鼠脑缺血再灌注后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h间的TNF-α浓度有统计学差异(F=44.876，P=0.000)，健康对照组、假手术组、模型组、预注射组的TNF-α浓度有统计学差异(F=155.648，P=0.000)，健康对照组、假手术组、模型组、预注射组的TNF-α浓度随时点变化规律不同(F=77.632，P=0.000)。模型组TNF-α造模后迅速升高，于脑缺血再灌注3 h开始显著高于健康对照组及假手术组(P<0.01)，于24 h达到高峰，随后开始下降，72 h仍高于假手术组及健康对照组(P<0.01)。预注射组与模型组比较，3、6、12、24 h TNF-α的含量显著降低(P<0.05)，见表1。

表1 预注射对脑缺血再灌注损伤过程中不同时点TNF-α的影响

再灌注72 h，预注射组神经功能评分显著低于模型组(t=5.938，P<0.01)；脑含水量显著低于模型组，显著高于健康对照组(F=51.843，P<0.01)；梗死体积百分比显著小于模型组(t=11.502，P<0.01)。见表2。

表2 预注射对脑缺血再灌注72 h后脑损伤的影响

2.2各时点干预对脑缺血再灌注后不同时点梗死体积百分比、脑含水量、神经功能评分的影响 脑缺血再灌注3、6、12、24 h干预效果明显，TNF-α干预组与他汀干预组都较模型组脑梗死体积明显减小(P<0.05)，TNF-α干预组减小脑梗死体积的作用较他汀干预组更加明显(P<0.05)。脑缺血再灌注48 h，他汀干预组与TNF-α干预组均不能减小梗死灶(P>0.05)。见表3及图1。3、6、12、24 h TNF-α干预组与他汀干预组均较模型组显著减少脑含水量(P<0.05)，TNF-α干预组效果更明显(P<0.05)，48 h TNF-α干预组、他汀干预组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。24 h内 TNF-α干预组与他汀干预组均较模型组显著减少神经功能评分(P<0.05)，3 h、6 h TNF-α干预组效果显著好于他汀干预组(P<0.05)，12、24 h两干预组效果无统计学差异(P>0.05)，48 h TNF-α干预组、他汀干预组分别与模型组比较无统计学差异(P>0.05)，见表5。可见，在脑缺血再灌注24 h内TNF-α对脑损伤有促进作用，超过24 h该作用将不再存在，抗TNF-α治疗不再有效，因此，抗TNF-α治疗越早越好，总体来看，对于减小梗死灶，减轻脑水肿及恢复神经功能，TNF-α干预效果好于阿托伐他汀。

表3 各时点干预后脑缺血再灌注各时点梗死体积比较

图1 各组脑梗死灶TTC染色

表4 各时点干预后脑缺血再灌注各时点脑含水量的比较

表5 各时点干预后脑缺血再灌注各时点神经功能评分的比较分)

3 讨 论

近年来缺血性脑血管病的发病机制研究取得了很大进展〔12〕。动脉粥样硬化(AS)是缺血性脑卒中发病的一个独立危险因素，研究发现，AS是一个由脂质与炎症共同作用的慢性炎症性疾病〔13〕，炎症可通过一系列病理，生理变化促进动脉硬化、硬化斑块破裂及在此基础上的血小板聚集、血栓形成，最终导致动脉阻塞。因而，脑缺血早期的炎症反应及其损伤作用日益受到关注，成为近年研究的热点〔14〕。TNF-α是由单核巨噬细胞产生的一种肽类激素，是机体抗感染反应出现最早和最主要的炎症因子之一〔15〕，可激活单核/巨噬细胞、中性粒细胞等，增强其吞噬杀伤功能，促进其释放炎症蛋白和炎性介质，是机体免疫炎性反应的重要调节因子〔16〕。TNF-α作为致炎因子除诱发和促进炎症以外，还可通过细胞毒性、凝血等反应及多种凋亡途径加剧缺血后损伤〔14〕。本研究采用经典的Longa 法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，即通过颅外置入线栓造成大脑中动脉缺血，这是目前研究MCAO-R最常用模型。该模型的主要优点是操作成功率高、可重复性好、并发症少、一致性脑梗死效果确实，能够更好地反映缺血性脑卒中的临床特点及病理过程〔17〕。本研究结果提示TNF-α在缺血性脑卒中的发病机制中起着重要作用。

TNF-α对缺血性脑卒中发病的促进作用不容忽视。TNF-α是缺血性脑卒中炎症反应的启动物质，是炎性组织中数量较大的早期介质之一，可上调其他炎症因子〔如白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8等〕的产生，同时激活招募单核-巨噬细胞，参与AS及缺血性脑损伤形成的全过程。TNF-α也能增加脂质信号传导介质如前列腺素和血小板激活因子，这些因子除影响血凝过程外，还可促成血管舒缩因子的下降和内皮素(ET)的增加从而引发血管收缩，增加局部脑卒中的危险性。因而，TNF-α早期的分泌合成与增加是脑梗死形成的主要原因〔18〕，此时下调炎性因子、阻止炎症联级反应，将对神经细胞具有一定的保护作用〔19〕。本研究进一步验证了TNF-α在脑缺血再灌注形成中的作用。

急性脑梗死后脑组织局部过度的炎症反应是造成脑损伤的主要原因之一，因此，阻断脑梗死后的炎症反应是改善梗死后脑损伤的重要手段〔20〕。然而，TNF-α对缺血性脑损伤的作用如何还存在争议。国内多数研究支持脑缺血后TNF-α的表达具有神经毒性。TNF-α 可上调血管内皮细胞和白细胞上的黏附分子的表达，加剧脑内炎症反应中性粒细胞与内皮细胞之间的黏附作用，阻碍脑组织的供血，损伤局部血管，导致血管通透性增加，促使脑缺血和水肿的发生，加重缺血性脑组织的损伤〔21〕。陈红芳等〔22〕报道脑梗死急性期血中TNF-α含量明显升高，且与ET、一氧化氮(NO)均呈正相关，证实了升高的TNF-α不仅严重地破坏了NO-ET轴的正向调节作用导致其失衡状态，而且促发和加重了脑梗死程度。TNF-α除了在炎性反应启动和维持中的作用外，也具有终止炎症的作用〔23〕。有研究认为，脑缺血后2～7 d，TNF-α刺激成纤维细胞、小胶质细胞和星形细胞表达神经生长因子，这有助于改善缺血状态和神经元生存。缺血后7～30 d，通过巨噬细胞和胶质细胞产生的丝氨酸激酶、微管蛋白-2激酶等，参与损伤组织吸收、修复和重塑〔24〕。临床研究发现，缺血性脑卒中恢复期TNF-α水平处于较高水平者预后良好，表明血清TNF-α水平的升高与发病后脑组织损伤的修复有关〔25〕，本研究发现，抗TNF-α干预在缺血性脑卒中发生24 h内干预效果显著，且干预越早，效果越好，而在缺血再灌注损伤恢复期尤其48 h 后再施加干预则无效。由此证实，缺血性脑卒中的不同时程TNF-α发挥不同作用。急性期表现为神经毒性作用，而恢复期则可能表现为神经修复作用，其修复作用尚需进一步验证。在脑损伤早期施加抗TNF-α干预，降低其促炎效应，可能是今后治疗脑缺血的一条新的有效途径〔19〕。