电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子复合物冻干注射剂中的21种元素

姜树银，张迅杰，张乃斌，李春焕，贺美莲，石峰，咸瑞卿

(山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室，山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心，山东 济南 250101)

血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)是由血管内皮细胞和骨髓巨核细胞合成的一种多结构域、多功能糖蛋白，在1期和2期止血中发挥重要作用[1-2]。人凝血因子Ⅷ(coagulation factor Ⅷ)是一种血浆糖蛋白，是内源性凝血途径中一种重要的凝血因子[3-6]。这两种因子均为人体内重要的凝血成分，一旦缺乏会引起不同程度的血友病，严重时会危及生命。人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子复合物冻干注射剂是目前此类疾病的最有效的治疗药物。该药物的生产工艺涉及沉淀、离心、吸附、层析、超滤、灭活等工序，所用仪器设备及物料均有可能引入重金属，监测该制剂中重金属元素的含量对于保证用药安全非常重要。目前，采用微波消解-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定药品中金属元素的方法较为成熟[7-9]，但尚无关于该产品中重金属元素检测方法的研究报道。本研究建立了ICP-MS测定人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子复合物冻干注射剂中21种常见金属元素含量的方法，为该制剂的质量控制提供了参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 7800型电感耦合等离子体质谱仪(Agilent公司)；MARS 6型微波消解仪(美国CEM Corporation公司)；EHD-40赶酸炉(北京东航科技有限公司)；A10纯水机(美国Millipore)；XSE205型电子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 主要试剂 单元素硼(B)、钪(Sc)、镁(Mg)、铝(Al)、硅(Si)、钒(V)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、锶(Sr)、锆(Zr)、钼(Mo)、铑(Rh)、钯(Pd)、锡(Sn)、钡(Ba)、铈(Ce)、铅(Pb)标准溶液(1 000 μg·L-1，Inorganic)；镉(Cr，1 000 μg·L-1，国家有色金属及电子材料分析测试中心)；硝酸(65%，UP级,苏州晶瑞化学股份有限公司)；超纯水(纯化水经A10纯水机过滤，电阻率<18 MΩ·cm。

1.3 样品 样品由山东泰邦生物制品有限公司提供，批号：202012S08、202012S09、202012S10。

2 方法与结果

2.1 仪器工作参数

2.1.1 ICP-MS条件 等离子体选择常规模式；功率为1 550 W，采样深度为10.0 mm，等离子气、雾化气、辅助气流量分别为15.0、0.99、0.9 L·min-1，He气流量为3.7 L·min-1，泵速为0.10 r·s-1，雾化室温度为2 ℃，积分时间为0.1 s，数据采集重复读取3次，扫描/重复次数为100，峰型为3，稳定时间为40 s；硼(B)元素采用No Gas调谐模式，其他元素采用He调谐模式，有效消除来自质谱的干扰。

2.1.2 微波消解程序 依据消解罐的数量，选择合适的功率。8～12罐：800 W,13～24罐：1 200 W,25～40罐：1 600 W。本研究选择1 200 W，升温程序：10 min内升温至120 ℃，保持2 min；5 min内升温至150 ℃，保持5 min，5 min内升温至190 ℃，保持20 min。

2.2 溶液制备

2.2.1 内标溶液 选择Sc(45)作为B(11)、Mg(24)、Al(27)、Si(28)、V(51)、Mn(55)、Fe(56)、Co(59)元素的内标；Ge(72)作为Ni(60)、Cu(63)、Zn(66)、Sr(88)、Zr(90)、Mo(95)元素的内标；In(115)作为Rh(103)、Pd(105)、Sn(118)、Ba(137)元素的内标；Bi(209)作为Pb(208)元素的内标。精密量取内标单元素标准溶液(1 000 μg·L-1)适量，用2%硝酸稀释至200 mL，使Sc(45)、Ge(72)、In(115)元素浓度为300 μg·L-1、Bi(209)元素浓度为100 μg·L-1。使用蠕动泵和T型混合三通在线添加，对分析信号进行校正，有效地克服信号漂移、消除一定的基体干扰。

2.2.2 混合标准元素线性溶液 精密量取21种单元素标准溶液(1 000 μg·mL-1)适量(见“1.2”项下主要试剂)，用2%硝酸溶液稀释至50 mL，作为混合标准元素线性溶液(1)～(7)，其浓度范围见表1。

2.2.3 供试品溶液和空白溶液 精密称取本品约0.5 g，置微波消化罐中，加入2 mL水，使润湿，加入8 mL硝酸，密封，浸泡过夜。置微波消解仪中，按“2.1.2”项下微波消解程序消解。冷却后取出，置赶酸炉中，130 ℃下赶酸至红棕色蒸汽挥尽后，继续浓缩至剩余溶液约为0.5 mL，放冷，用水转移并定容至25 mL离心管中，摇匀，即得。不加样品，同法制备空白溶液。

2.3 测定法

2.3.1 线性关系和线性范围 取“2.2.2”项下混合标准元素线性溶液，按“2.1.1”项下ICP-MS 条件进样测定，记录仪器相应值。以待测元素浓度为横坐标，待测元素响应值(CPS值)与内标元素响应值(CPS值)的比率为纵坐标，进行线性回归(仪器自动计算)。结果见表1。

表1 混合标准元素线性溶液浓度、范围、回归方程(μg·L-1)

2.3.2 检出限(LOD)与定量限(LOQ) 取2%硝酸溶液，连续进样11次，计算待测元素CPS值与内标CPS值比率的标准偏差SD，以3倍的标准偏差与线性方程中斜率的比值为检出限，以10倍的标准偏差与线性方程中斜率的比值为定量限，结果见表2。

表2 检出限与定量限结果(μg·L-1)

2.3.3 精密度 取混合标准元素线性溶液(4)，重复进样6次，计算检测值的RSD(%)，结果见表3。

表3 精密度结果(μg·L-1)

2.3.4 回收率 照第“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法，同时加入适量浓度的单元素标准溶液，平行制备6份，进样检测，计算回收率(%)和RSD(%)，结果见表4。

表4 回收率结果(%)

2.3.5 重复性 照第“2.3.4”项下回收率中供试品溶液的制备方法，平行制备6份，计算回收率(%)和RSD(%)，结果见表5。

表5 重复性结果(%)

2.3.6 样品检测结果 取本品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样检测，计算样品中各元素的含量。结果见表6。表6中S08-3、S09-3、S10-3和S08-6、S09-6、S10-6为本品202012S08、202012S09、202012S10按加速试验条件[(40±2)℃，75%±5%]存放3个月和6个月的检测结果。

表6 样品中各元素含量检测结果(μg·L-1)

3 讨论

《中国药典》2020年版人血白蛋白铝残留量测定法第二法收载了ICP-MS法。参照此法，采用5%硝酸沉淀蛋白4 h后，离心滤过，上样测定，结果显示基质干扰大，结果重现性差。研究发现，该方法蛋白沉淀不完全，易带来较大仪器污染导致测定结果出现较大波动。本研究采用微波消解法，通过优化样品取样量、消解液用量、消解时间、消解温度等参数，建立了适用的样品前处理方法，采用该方法样品消解完全，溶液澄清，降低了酸对采样锥的损坏，并消除其他试剂引入带来的基体干扰，测定结果重现性良好。该方法快速简便、灵敏度高、准确性好，不仅适用于人凝血因子Ⅷ/血管性血友病因子复合物冻干注射剂中金属元素的检测，而且可为其他血液制品中金属元素含量的测定提供参考。