常绿钩吻碱平衡溶解度、油水分配系数及解离常数的测定

蒋文文，张媛洁，李高攀，宋煜，吴水生

(福建中医药大学药学院，福建 福州 350122)

常绿钩吻碱(sempervirine，SPV，见图1)为钩吻中微量的育亨宾型生物碱，1949年从钩吻中首次分离，其化学结构和特征陆续被Nature、JACS等文献报道[1-2]，也逐渐因其具有显著抗肿瘤、镇痛抗炎等生物活性而被广泛关注[3-5]。课题组前期对钩吻生物碱单体进行抗肿瘤活性评价，发现SPV具有显著抗神经胶质瘤的作用，其有效抗肿瘤质量浓度低至0.273 μg·mL-1[6]。此外，课题组在给小鼠口服灌胃SPV 2 g·kg-1时发现小鼠于给药后1周内一直存活，且它对蟾蜍鼻纤毛也无毒性作用，提示其可能具有良好的安全性。因此，无论从有效性还是安全性方面皆证实SPV的成药性潜力巨大。截至目前SPV未有上市的产品，为了便于SPV的临床应用，课题组欲将SPV进行剂型开发，但国内外很少有关于SPV理化性质和生物学性质的研究报道。故本文对SPV进行了理化参数的研究，考察了SPV在不同pH磷酸盐缓冲溶液中的平衡溶解度和正辛醇-PBS系统的油水分配系数、并测定了SPV的解离常数，从而有助于预测药物在体内的吸收情况，并为其剂型设计提供依据。

图1 SPV的结构式

1 仪器与试药

Waters Acquity UPLC system超高效液相色谱仪(配有四元溶剂管理器、样品管理器和PDA检测器，沃特世公司)；pH计(常州奥豪斯仪器有限公司)；ZHWY-200D恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；H2050R高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；ME204E型万分之一电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；GT-2120QTS智能超声波清洗机(广东固特超声股份有限公司)；Milli-Q型超纯水仪(美国Millipore公司)；紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。

常绿钩吻碱对照品(武汉天植生物技术有限公司，批号:CFS201902，规格:5 mg，纯度≥98%)；常绿钩吻碱样品(由福建中医药大学药学院3408实验室提供，纯度≥98%)；正辛醇(上海麦克林生物化学有限公司，批号：C12180043)，甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Acquity UPLC BEN C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流动相:乙腈-0.5%甲酸水，流速:0.25 mL·min-1，检测波长:242 nm，柱温:45 ℃，进样量:2 μL，色谱图见图2。

A.SPV对照品色谱图；B.SPV样品色谱图

2.2 对照品溶液的制备 精密称取SPV对照品1.0 mg置5 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得对照品溶液。

（1）改变经济发展模式，大大优化农业产业结构。在水价政策的推动下，转变村民的理念，大力发展以节水增收为原则的温室大棚，以养羊为主的温棚，以及特色产业如酿酒，红枣，枸杞等特色产业的发展。

2.5 线性范围考察 分别取2.2项下SPV对照品溶液0.125、0.375、0.625、0.875、1.25、1.5 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)进行回归，得回归方程Y=30 048X-62 693(r=0.999 9)，线性范围2.5～30 mg·L-1。

2.4 专属性试验 对照品溶液、供试品溶液、空白溶液在“2.1”项下色谱条件下乙腈-0.5%甲酸水溶剂测定无干扰，专属性良好。

2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液，甲醇稀释到适当浓度，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，精密度的RSD值为1.10%，表明仪器精密度良好。

pKa=pH + lg[(A-Au)/(Ai-A)]

Au为分子状态下的吸光度，Ai为解离状态下的吸光度，A为混合状态下的吸光度。

随机通达教学的基本原理是：对于同一教学内容，要在不同时间，在重新安排的情境下。带着不同的目的，从不同的角度多次学习，由此来达到高级知识获得的目标。（李明振等，2007））这就要求教师教学活动设计要灵活变换形式，每次知识点的呈现都有不同的学习目的，不同的侧重点，而并非知识的简单重复，此外，还要注重知识的情境性。

2.9 回收率试验 取对照品溶液用甲醇稀释到高、中、低浓度，按照“2.1”项下色谱条件分别进样3次，测得回收率分别为99.47%、99.76%、100.37%，RSD分别为0.85%、1.02%、1.44%，符合测定要求。

3 平衡溶解度的测定

步骤3 根据上层模型决策变量Wli的值Wlit，代入上层模型的目标函数中，获得上层函数目标g值，当g符合满意值范围时(上层约束条件)，转入步骤4；当g不符合满意值范围时，转入步骤1，置t=t+1,重新选取区域医疗卫生资源(医生、医疗床位)配置的决策变量的值，直g到符合满意值范围为止；

按照《中国药典》2020年版(四部)通则[7]，分别配制pH分别为1.2、2.0、4.0、6.8、7.4的磷酸盐缓冲液，取过量SPV于5 mL具塞离心管中，分别加入不同pH(1.2、2.0、4.0、6.8、7.4)的磷酸盐缓冲液，超声20 min，在37 ℃恒温振荡器振摇48 h后迅速取出，于离心机37 ℃，15 000 r·min-1离心10 min，取上清液用甲醇适当稀释，过0.22 μm滤膜，吸取续滤液，在“2.1”项下色谱条件下测定，平行操作3次，记录峰面积，计算其浓度。结果见图3，结果表明SPV在pH 1.2～6.8的磷酸盐缓冲液中的溶解度随pH的增大而增大，在pH 6.8～7.4的磷酸盐缓冲液中的溶解度随着pH增大逐渐减小。

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图3 SPV在不同pH磷酸盐缓冲液中溶解度(n=3)

4 油水分配系数的测定

精密吸取含SPV的水饱和正辛醇2 mL，置5 mL具塞离心管中，分别加入不同pH(1.2、2.0、4.0、6.8、7.4)的磷酸盐缓冲液，37 ℃超声溶解20 min，将具塞离心管放入恒温振荡器中，控制温度(37±0.5)℃,振摇48 h直至平衡，离心10 min(15 000 r·min-1，37 ℃)，取上清液用甲醇稀释到适当浓度，经0.22 μm滤膜滤过，吸取续滤液，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，平行操作3次，记录峰面积。分别计算其浓度，并计算表观油水分配系数Papp，计算公式如下：

Papp=Co/Cw

公式(1)

Co为平衡时SPV在正辛醇中的浓度，Cw为平衡时SPV在水相中的浓度。

SPV在pH 1.2～6.8的磷酸盐缓冲液中的油水分配系数随pH的增大而减小，在pH 6.8～7.4的磷酸盐缓冲液中的油水分配系数趋于平缓，随着pH增大逐渐增大，结果见图4。

启发教学实践中，教师最重要的就是要摆正自己的主导位置，把课堂的主动权交付给学生，让学生变成课堂教学的主动参与者，而教师则是负责引导学生进行探究性学习，充分肯定学生在课堂上的积极表现，鼓励学生大胆自主创新，激发学生创造力。

图4 SPV在不同pH磷酸盐缓冲液中油水分配系数(n=3)

5 解离常数的测定

精密称取SPV 5 mg置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇超声溶解后用甲醇定容至刻度，摇匀后作为储备液备用。取0.5 mL储备液于25 mL容量瓶中，加入不同pH的磷酸盐缓冲液定容至刻度，室温下进行200～400 nm范围内紫外扫描[8-10]。测定药液在254 nm和274 nm处的吸光度(A)值，计算pKa。计算公式如下：

2.7 重复性试验 供试品的制备方法制备6份供试品溶液，甲醇稀释到适当浓度，按“2.1”项下色谱条件进样，计算RSD值为1.48%，表明方法重复性良好。

公式(2)

2.8 稳定性试验 取对照品溶液用甲醇稀释到高、中、低浓度，按照“2.1”项下色谱条件连续7 d进样，检测峰面积并计算RSD分别为1.33%、0.94%、0.62%。RSD均小于2%，表明常绿钩吻碱在7 d内基本保持稳定。

[9]...goals for the country’s development,“common prosperity”,is looking far harder to attain.Even if richer provinces were to slow down,they reckoned,the high growth potential of inland regions would compensate for that.（2016-10-01）

2.3 供试品溶液的制备 取样品溶液适量(制备方法见平衡溶解度测定)，经0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，加甲醇稀释一定倍数得供试品溶液。

由图5可知SPV在pH 9.99～10.37范围内吸光度无明显变化，可看作离子状态；在pH 10.37～11.16吸光度随pH增加而增大，此时为离子和分子的混合状态；在pH 11.64～11.99范围内在同一波长下的紫外吸收行为一致，可看作分子状态。将所测得的A值代入上述解离常数pKa公式，结果见表1，得SPV的pKa值为11.10±0.15。

图5 SPV在不同pH磷酸盐缓冲液中的吸光度(n=3)

表1 SPV的pKa值测定结果

6 讨论

由于人体正常温度在37 ℃左右，所以选择37 ℃作为药物溶解度和油水分配系数的测定温度。SPV平衡时间分别考察了12、24、48和72 h，结果发现SPV在48 h时达到溶解平衡，故选择48 h为平衡时间。正辛醇的溶解度参数与细胞膜的溶解度参数相近，对药物透过细胞膜能力有一定的参考性[11]，因此选择正辛醇-PBS体系测定药物的油水分配系数。

平衡溶解度是评价药物溶解性能的重要参数[12]，从测定结果可以看出，在pH 1.2～7.4磷酸盐缓冲液中，SPV的平衡溶解度为285.356～557.945 mg·L-1，SPV在此pH环境内溶解度均较低。

相对于一般决策，在侦查过程中，侦查工作有着很强的时限性，绝大多数侦查决策都需要在十分有限的时间内作出决策。如在案件发生后，有目击者反映犯罪分子的体貌特征、逃跑路线等，作为侦查指挥人员，需要在短时间内作出决策，是完全相信目击者的证言还是对其证言保留怀疑呢?是进行通缉通报还是进行追缉堵截呢?而这时侦查人员所能够收集到的信息不可能是充分的，更不可能将所有能够收集的信息都收集到后再从容作决策。决策时间紧迫决定了侦查决策必然具有很大的风险。

油水分配系数是反映药物透膜吸收、评价药物脂溶性大小的重要指标[13]，研究表明药物口服最佳吸收范围的油水分配系数为-1

解离常数是反映药物在不同pH环境下的解离状态，通常药物以分子形态透过细胞膜进行药物吸收，解离后的离子状态不易透过细胞膜，难以吸收[15]。本研究采用紫外分光光度法测得SPV的解离常数为11.10，分子结构中有季铵盐结构，属于碱性化合物。因此，SPV在体内生理pH环境中可能多以解离型形式存在，而非易于透膜吸收的分子形态，推测其解离状态将会影响其透膜吸收能力。

综上所述，本研究通过对SPV平衡溶解度、油水分配系数和pKa的考察，推测SPV在生物膜上的渗透性和体内吸收。根据平衡溶解度结果可知，SPV虽然有一定的亲脂性，然而它溶解度低，且绝大多数以离子形式存在，它在生理pH的环境中吸收有限[16]。因此，在SPV的新制剂设计开发时，须采用药剂学手段进一步提升其溶解度，如可考虑通过制成微乳[17]等剂型的方法提高溶解度，促进渗透吸收，增加药物生物利用度。本研究结果为SPV剂型的开发和研究提供理论参考依据。